La proteína supresora de tumores Retinoblastoma : caracterización de su dominio AB y mecanismo de interacción con la oncoproteína E7 del papilomavirus humano

• Autores: Chemes, Lucía Beatriz
• Año de publicación: 2010
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: de Prat Gay, Gonzalo
• Materia: RETINOBLASTOMA; HPV-E7; MOTIVO LXCXE; PROTEINAS VIRALES; MODULARIDAD; PROTEINAS HUB; HPV-E7; LXCXE MOTIF; VIRAL PROTEINS; MODULARITY; HUB PROTEINS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La proteína supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una proteína "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en células eucariotas, y su inactivación funcional se encuentra asociada a la progresión del cáncer en humanos. En particular, la interacción de la proteína HPV-E7 con Rb se encuentra relacionada al poder oncogénico del papilomavirus humano (HPV). El atraso en los estudios estructura-función de Rb se debe en gran medida a la dificultad para la producción recombinante y el estudio en solución de esta proteína o sus dominios. En la presente tesis, nos avocamos al estudio en solución del dominio RbAB humano, que media una gran parte de las funciones de esta proteína incluyendo la interacción con HPV E7. Para ello, desarrollamos un protocolo para su expresión recombinante que permitió obtener rendimientos de 6 mg/litro con una pureza final mayor al 95%. Estudios biofísicos revelaron que RbAB se encuentra en solución como un monómero plegado a 20°C. RbAB es marginalmente estable a temperatura fisiológica, y estudios de plegamiento sugieren que los sub-dominios RbA y RbB tienen diferente estabilidad en solución. Estos estudios representan el primer análisis sobre las propiedades conformacionales en solución de este dominio. En la segunda parte de la tesis realizamos un análisis termodinámico y cinético de la interacción entre RbAB y HPV16-E7 en solución. Estos estudios revelaron que el 90% de la energía de interacción es aportado por el motivo lineal de alta afinidad LxCxE, pero que otros sitios secundarios en E7 participan de la interacción con el dominio RbAB, indicando que la misma es de carácter modular. El caracter intrínsecamente desordenado de E7 modula la interacción, y la fosforilación de la región CKII-PEST potencia la afinidad del complejo. Estudios cinéticos revelaron que la unión del motivo LxCxE a RbAB sigue un mecanismo de dos estados, con una asociación rápida y un tiempo de vida en el órden de 20-200 seg. El complejo E7-RbAB se encuentra estabilizado por interacciones de tipo electrostático, que podrían determinar al menos en parte la especificidad de la interacción de las diferentes proteínas E7 de papilomavirus. El estudio mecanístico de las interacciones proteína-proteína es esencial para comprender el funcionamiento de las intrincadas redes de interacción presentes en las células, y la presente tesis aporta información sobre una de estas interacciones, tomando como proteína modelo a una proteína clave para el desarrollo de tumores humanos. Dado que el motivo LxCxE se encuentra conservado en numerosas proteínas virales y celulares que unen a Rb, los estudios presentados sientan las bases para el análisis de los mecanismos que permiten la discriminación de diversas proteínas que compitan por la unión al "surco LxCxE".
The retinoblastoma tumor suppressor protein (Rb) is a hub protein wich plays a central role in cell cycle regulation in eukaryotic cells, and whose functional inactivation is associated with tumor progression in humans. In particular, the oncogenicity of high-risk human papillomavirus (HPV) depends critically on the interaction of one of its proteins, HPV-E7, with Rb. The delay in the understanding of structure-function relationships for Rb is due, to a large extent, to the difficulty in obtaining large quantities of pure protein which is amenable to biophysical analyses. In the present thesis, we studied the biophysical and interaction properties of the human RbAB domain, which mediates many of Rb's functions, amongst them the interaction with E7. We developed a protocol for its recombinant expression which allowed us to obtain up to 6 mg/liter of recombinant protein with >95% purity. Biophysical studies showed that RbAB is a folded monomer at 20°C, but that it has marginal stability at the mammalian body temperature (37°C). Folding studies strongly suggest that the A and B domains have different thermodynamic stability. This work represents the first study of conformational properties of the RbAB domain in solution. In the second part of this thesis, we performed thermodynamic and kinetic analysis of the interaction between HPV-E7 and RbAB. These studies showed that 90% of the binding free energy is provided by the high affinity LxCxE linear motif, but that multiple regions in E7 additionally participate of the interaction, pointing to its modular nature. The intrinsically disordered nature of E7 modulates binding, and phosphorylation at a conserved CKII-PEST site potentiates binding affinity. Kinetic studies revealed that the LxCxE motif binds through a two-state route with a fast association, which is favoured by electrostatic interactions, and a complex lifetime of 20-200s. The electrostatic nature of the interaction may explain at least in part the binding specificity of different papillomavirus E7 proteins. The mechanistic study of protein-protein interactions is essential to the understanding of the complex cellular protein interaction networks, and the present thesis provides biophysical information on one of these interactions, using the E7-Rb interaction as a model system. Given that the LxCxE motif is conserved throughout viral and cellular Rb partners, the information provided by this work may set the grounds for analyzing the mechanisms of discrimination of multiple possible targets which bind the "LxCxE cleft".
Fil: Chemes, Lucía Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.