Estudio y caracterización funcional de la interacción de la E3 ligasa CRL4Cdt2 con el complejo regulador de la cromatina G9a GLP

• Autores: Enriqué Steinberg, Juliana Haydeé
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Rossi, Mario
• Materia: SISTEMA UBIQUITINA PROTEOSOMA; E3 LIGASAS; CRL4CDT2; UBIQUITINA; G9A/GLP; UBIQUITIN PROTEASOME SYSTEM; E3 LIGASES; CRL4CDT2; UBIQUITIN; G9A; G9A/GLP
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La formación y progresión de tumores está regulada en última instancia por la abundancia y la actividad de factores proteicos oncogénicos o supresores tumorales. En línea con esto se ha demostrado que la proteólisis irregular de factores proteicos implicados en la regulación del ciclo celular, la transcripción génica y la apoptosis contribuye a la transformación oncogénica y a la carcinogénesis. En células eucariotas, la homeostasis proteica está finamente regulada por el Sistema Ubiquitina/Proteosoma (Ubiquitin Proteosome System, UPS), que consiste en una compleja red enzimática encargada de transferir moléculas de ubiquitina a un sustrato y de este modo promover su degradación a través del proteosoma o modular su ubicación espacio temporal en una vía celular determinada. Por lo tanto, el estudio a nivel molecular de la cascada de ubiquitinación, junto con el desarrollo de compuestos que modulan componentes específicos del UPS, podrían facilitar el desarrollo y mejoramiento de nuevos y mejores tratamientos de distintas patologías. En este sentido, las ligasas de ubiquitina (o E3s) son excelentes candidatas debido a que estas enzimas son los efectores finales de la cascada de ubiquitinación y dictan la especificidad de la maquinaria del UPS. La E3 ligasa CRL4^Cdt2 desempeña un rol fundamental en la regulación de la replicación y reparación del ADN, en condiciones normales como así también en respuesta al daño al ADN. Diferentes evidencias indican que las alteraciones en los niveles de CRL4^Cdt2 pueden contribuir a la aparición y progresión del cáncer. Todos los sustratos conocidos de CRL4^Cdt2 tienen un dominio PIP (PCNA Interacting Protein) que interactúa con PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) asociado a la cromatina, y es precisamente la unión de los sustratos a PCNA lo que asegura su degradación. Por este motivo, con el objeto de identificar nuevos sustratos de CRL4^Cdt2 que permitan ahondar en el mecanismo molecular de acción de este complejo, se realizó una purificación por afinidad en tándem de Cdt2 sobre-expresado y posterior espectrometría de masa en tándem en la fracción cromatínica. A partir de estos resultados se escogieron distintos candidatos teniendo en cuenta la frecuencia de aparición de los mismos en las distintas purificaciones y se logró validar la interacción de Cdt2 sobre-expresado en la cromatina con G9a y GLP. Estas proteínas son metiltransferasas de histonas que catalizan la mono y la dimetilación de la Histona 3 en la Lisina 9, esta marca epigenética se encuentra relacionada con silenciamiento transcripcional y es indispensable para la constitución de la heterocromatina. Debido a que G9a tiene la capacidad de metilar también proteínas no histónicas realizamos un análisis de modificaciones postraduccionales de Cdt2 en una línea control y en líneas knockout que no expresan G9a y GLP (generadas por el sistema CRISPR/Cas9), donde no se encontraron péptidos de Cdt2 metilados diferencialmente en la línea control, aunque se requieren estudios adicionales y más detallados para obtener una respuesta más sólida y definitiva. Logramos identificar y validar la interacción de Cdt2 con otras dos proteínas que interactúan con el complejo G9a/GLP y median su interacción con el ADN. Utilizando ARN de interferencia de Cdt2 comprobamos que la vida media de las proteínas que forman parte de este complejo no se encuentra regulada por esta E3 ligasa, así como tampoco la localización subcelular. Debido a que el silenciamiento de Cdt2 ocasiona re-replicación e inestabilidad genómica, desarrollamos también una línea celular que no expresa Cdt2 endógeno y expresa una construcción Cdt2-Flag que es inducible con doxiciclina. Los experimentos de vida media en diferentes clones de esta línea celular confirmaron los resultados obtenidos con ARN de interferencia. Por último, es importante destacar que CRL4^Cdt2 también cumple un rol importante en la regulación de la respuesta celular a estrés genotóxico. Asimismo, recientemente se ha reportado que G9a interviene en la regulación de la respuesta al daño al ADN. Por lo tanto, estamos actualmente estudiando si la interacción funcional entre CRL4^Cdt2 y G9a/GLP posee una función importante en la modulación de la respuesta celular a distintos daños. En este sentido hemos obtenidos resultados preliminares muy alentadores. Esperamos que en estudios posteriores podamos ahondar en la caracterización molecular del eje CRL4Cdt2/G9a y la función que cumple en el control de la integridad genómica.
The formation and progression of tumors is ultimately regulated by the abundance and activity of oncogenic protein factors or tumor suppressors. Accordingly, aberrant proteolysis of substrates involved in the regulation of cell cycle, gene transcription, and apoptosis has been shown to contribute to carcinogenesis. In eukaryotic cells, protein homeostasis is tightly regulated by the Ubiquitin Proteasome System (UPS), which consists of a complex enzymatic network responsible for transferring molecules of ubiquitin to a substrate and thereby promote its degradation through proteasome or modulate its spatio-temporal localization in a specific cell pathway. Therefore, the molecular study of ubiquitination cascades, together with the development of compounds that modulate specific components of the UPS, could facilitate the development and improvement of new and better strategies for the treatment of different pathologies. Accordingly, the ubiquitin ligase protein group (or E3s) represents an excellent candidate, because these enzymes are the final effectors of the ubiquitination cascade and thus dictate the specificity of UPS machinery. E3 ligase CRL4^Cdt2 plays a key role in the regulation of DNA replication and repair, in normal conditions as well as in response to DNA damage. Different lines of evidence indicate that alterations in the levels of CRL4Cdt2 may contribute to the onset and progression of cancer. All known substrates of CRL4^Cdt2 have a PIP domain (PCNA Interacting protein) that interacts with PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) associated with chromatin, and it is precisely the binding of the substrates to PCNA which ensures its timely degradation. Hence, with the aim to gain further insight into the molecular mechanisms of action of CRL4^Cdt2, we performed a tandem affinity purification of overexpressed Cdt2 and subsequent tandem mass spectrometry using only the chromatin cellular fraction. Using this strategy, among the most abundant putative Cdt2 protein interacting factors, we identified and validated the interaction between overexpressed Cdt2 and G9a/GLP. These two proteins are histone methyltransferases that catalyze the mono and dimethylation of Histone 3 in Lysine 9, which plays an important role in the transcriptional silencing process and is necessary for heterochromatin domains formation. G9a has also the ability to methylate non-histone proteins, and for this reason we performed post-translational modifications analysis of Cdt2 on knockout cell lines that do not express G9a and GLP, that were generated by the CRISPR/Cas9 system. So far, we do not find significant differences between normal and knockout cell lines although further and more detailed studies are required to obtain a more robust and definitive answer. We were able to identify and validate the interaction of Cdt2 with two other proteins that interact with the G9a/GLP and mediate their interaction with the DNA. Using interference RNA against Cdt2, we found that CRL4^Cdt2 does not regulate the half-life of the G9a/GLP protein complex, neither its subcellular localization. Because Cdt2 silencing causes re-replication and genomic instability, we also developed a cell line that does not express endogenous Cdt2 but harbors a doxycycline inducible Cdt2-Flag construct that allowed us to perform half-life experiments without affecting overall cellular homeostasis. Using different clones, we confirmed the results obtained with small interfering RNA. Finally, as mentioned before, it is well established that CRL4Cdt2 plays an important role in the regulation of the genotoxic stress response. Accordingly, recent reports indicate that G9a also intervenes in the regulation of the response to DNA damage. Therefore, we are currently studying whether the functional interaction between CRL4^Cdt2 and the G9a/GLP complex plays an important role in the modulation of the cellular response to different DNA damage agents. In this regard, we have obtained very encouraging preliminary results. Further studies are required to unveil the specific and intricate molecular mechanism of action of the CRL4^Cdt2/G9a axis and its role in the control of genomic stability.
Fil: Enriqué Steinberg, Juliana Haydeé. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.