Estudio de las propiedades replicativas in vitro de la cepa A663 de Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5) y de la función de la proteína Us3

• Autores: Ladelfa, María Fátima
• Año de publicación: 2010
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Romera, Sonia Alejandra
• Materia: HERPESVIRUS; BOHV-5; REPLICACION IN VITRO; PROTEINA US3; FIBRAS DE ESTRES; PROYECCIONES CELULARES; HERPESVIRUS; BOHV-5; IN VITRO GROWTH PROPERTIES; US3 PROTEIN; STRESS FIBERS; CELL PROJECTIONS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Este trabajo de tesis contribuyo a la caracterizacion de la cepa argentina A663 de Herpesvirus Bovino tipo 5 (BoHV-5) mediante el estudio de sus propiedades replicativas in vitro y del rol de la proteina Us3. En el primer caso se realizaron cineticas de crecimiento y se evaluaron los tamanos de las placas de lisis y de infeccion de las cepas A663 y N569 de BoHV-5. La produccion total de particulas virales infectivas en funcion del tiempo fue similar entre ambas cepas, sin embargo la cepa A663 resulto menos eficiente en la liberacion de particulas virales al medio extracelular y en la dispersion celula a celula, observandose para la cepa A663 una reduccion del 90% y del 80% en el tamano de la placa de lisis y de infeccion, respectivamente. Por otro lado, se secuencio la region codificante para la proteina Us3 de la cepa A663 de BoHV-5 y se observo un alto porcentaje de homologia con las secuencias correspondientes a otras cepas de BoHV-5. Mediante las tecnicas de Northern y Western blot se demostro que el gen us3 se expresa tempranamente (desde los 30 minutos post infeccion) y de manera prolongada (hasta las 48 horas post infeccion). Los ensayos in vitro se realizaron utilizando construcciones que expresaban la proteina Us3 wt o una version mutante de esta proteina que carece de actividad de proteina quinasa, fusionadas a la proteina fluorescente ECFP (US3-ECFP y Us3K261D-ECFP). Se observo que la proteina Us3 de BoHV-5 induce el redondeamiento celular y provoca el desensamblado de las fibras de estres, siendo estos efectos independientes de su funcion de quinasa. Ademas, la proteina mutante Us3K261D disminuyo la formacion de proyecciones de celulares y modifico la localizacion subcelular de la proteina Us3 de BoHV-5. En conjunto, los resultados obtenidos permitieron conocer las propiedades replicativas in vitro de la cepa A663 de BoHV-5 y constituyeron el primer reporte sobre el estudio de la funcion de la proteina Us3 de BoHV-5.
This thesis contributed to the characterization of the Argentinean bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) A663 strain by studying its in vitro growth properties and the function of the Us3 protein. Firstly, growth kinetics, lysis and infection plaque size assays were performed for BoHV-5 A663 and N569 strains. The total amount of infection virus produced was similar between both strains at each time assayed; however, A663 strain was less efficient than N569 strain in releasing infective viral particles to the extracellular media and in cell-to-cell spread, as shown by a reduction of 90% and 80% in its lysis and infection plaque size, respectively. On the other hand, the region encoding the Us3 protein of BoHV-5 A663 strain was sequenced and high homology was observed between it and other sequences of BoHV-5 strains. Then, early (from 30 minutes post infection) and prolong (up to 48 hours post infection) expression of us3 gene was demonstrated by Northern and Western blots assays. Finally, in vitro studies were performed with genetic constructions to express wt Us3 protein or a mutated version of this protein lacking its kinase activity, fused to the fluorescent protein ECFP (Us3-ECFP and Us3K261D-ECFP). In transient transfection assays it was observed that Us3 BoHV-5 protein induced cell rounding and stress fiber breakdown independently of its kinase activity. Besides, the point mutation in the Us3K261D protein reduced cell projections formation and modified the subcellular localization of BoHV-5 Us3 protein. Taken together, these results allowed the assessment of the in vitro growth properties of BoHV-5 A663 strain and constituted the first report of the function of the BoHV-5 Us3 protein.
Fil: Ladelfa, María Fátima. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.