Consecuencias de mutaciones y polimorfismos sobre la actividad de ADAMTS13

• Autores: Calderazzo Pereyra, Julio César
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Lazzari, María A.
• Materia: ADAMTS13; DOMINIO CUB-2; A4085T; MUTAGENESIS SITIO-DIRIGIDA; MUTACION DE SENTIDO ERRONEO D1362V; ADAMTS13; CUB-2 DOMAIN; A4085T; SITE-DIRECTED MUTAGENESIS; D1362V MISSENSE MUTATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los objetivos de esta tesis fueron: 1- Optimizar la amplificación de los 29 exones correspondientes al gen de ADAMTS13 y realizar la secuenciación completa del gen en pacientes con PTT congénita y 2- Realizar la expresión “in vitro" de la primera nueva mutación descripta en Argentina A4085T (sustitución de un ácido aspártico (D) por una valina (V) en la posición 1362). Evaluar la actividad proteolítica intra y extracelular de la ADAMTS13 resultante para analizar cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de células HEK 293 transfectadas con las construcciones plasmídicas de la secuencia WT y del mutante A4085T sintetizado a partir del plásmido WT por mutagénesis sitio-dirigida para evaluar cuál es el dominio afectado y cómo impacta sobre los mecanismos de biosíntesis y secreción de la ADAMTS13. Estos estudios ayudaron a una mejor evaluación del exón 29 del dominio CUB-2. Para medir el antígeno y la actividad de ADAMTS13 en células, sobrenadantes y células transfectadas con vector de expresión de ADAMTS13 WT y de A4085T, se utilizaron técnicas de ELISA con sustratos cromogénicos, técnicas de SDS-PAGE, inmuno-transferencia y microscopia de inmunofluorescencia. Se observó que la mutación produce acumulación intracelular de ADAMTS13. La nueva mutación D1362V identificada en el dominio CUB-2 codificada por el exón 29, donde aún no se han reportado mutaciones de sentido erróneo, produce una deficiencia plasmática de ADAMTS13 que estaría inducida por una secreción reducida de la proteasa a la circulación.
The aims of this thesis were: 1- To optimize the amplification of the ADAMTS13 gene 29 exons, and to perform the complete sequencing of this gene in patients with hereditary TTP, and 2- To perform the in vitro expression of the first new mutation described in Argentina, A4085T (substitution of an aspartic acid [D] for valine [V] at position 1362). The resulting ADAMTS13 intra and extracellular proteolytic activity will be evaluated to analyze its impact on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. The experiments were performed in cultures of HEK 293 cells transfected with plasmid constructions of the WT sequence, and of the A4085T mutant synthesized from the WT plasmid through site-directed mutagenesis, in order to evaluate which the affected domain is and how it impacts on ADAMTS13 biosynthesis and secretion mechanisms. These studies have helped to improve the evaluation of exon 29 at CUB-2 domain. ADAMTS13 antigen and activity on cells, supernatants and cells transfected with expression vector of ADAMTS13 WT and of A4085T, were measured by ELISA with chromogenic substrates, SDS-PAGE, immune transference technics applied and immunofluorescence microscopy. It was observed that the mutation produces intracellular accumulation of ADAMTS13. The new D1362V mutation identified in CUB-2 domain and encoded by exon 29, where no missense mutations have been reported yet, produces a plasmatic deficiency of ADAMTS13 that could be induced by a reduced secretion of circulating protease.
Fil: Calderazzo Pereyra, Julio César. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.