Activación de vías involucradas en la apoptosis y proliferación en huvec. Agonistas relacionados con hormonas determinantes del sexo. Efecto sobre la liberación del factor Von Will...

• Autores: Powazniak, Yanina
• Año de publicación: 2008
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Lazzari, María Angela
• Materia: VWF; ADAMTS13; ESTRADIOL; PROGESTERONA; TESTOSTERONA; HISTAMINA; PROLIFERACION; APOPTOSIS; VWF; ADAMTS13; ESTRADIOL; PROGESTERONE; TESTOSTERONE; HISTAMINE; PROLIFERATION; APOPTOSIS; PROGESTERONE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El VWF es una glicoproteína adhesiva, sintetizada en las CE y megacariocitos. Se sintetiza en forma monomérica, luego se organiza en dímeros y se multimeriza. El VWF media la adhesión de plaquetas al subendotelio vascular dañado y lel transporte del factor FVIII. La ADAMTS13, proteasa que cliva al VWF, pertenece a la familia de metaloproteasas ADAMTS, llamadas así por la combinación característica de una desintegrina y una metaloproteasa con motivos trombospondina tipo 1. La ADAMTS13 es sintetizada en el hígado. Además, se ha demostrado que se sintetiza y almacena en las CE, y que tiene actividad en los lisados celulares en condiciones estáticas y de flujo. La ADAMTS13 está involucrada en el proceso fisiológico de clivar a los multímeros extragrandes altamente trombogénicos, que cuando están presentes en el plasma o en la superficie de las CE llevan a una agregación intravascular y a la formación de un trombo plaquetario. Hemos observado que los niveles de ADAMTS13 descienden, mientras que los del VWF aumentan a medida que progresa el embarazo. En 1972, varios autores han descripto el aumento del 17β estradiol. También se ha observado que la administración de estradiol a las CE en dosis no fisiológicas produce un aumento de VWF. Hay antecedentes acerca de la acción de las hormonas determinantes del sexo en la muerte o proliferación celular en distintas líneas celulares y cultivos primarios. Se demostró la existencia de un factor embrionario liberador de histamina y una alta expresión de receptores para histamina durante la gestación en humanos. Además, se observó un aumento en los niveles de histamina en las últimas semanas de gestación en modelos de ratas y hamsters dorados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1- analizar si los cambios hormonales que inducen o inhiben la síntesis o liberación de VWF y ADAMTS13 tienen influencia en la muerte o proliferación celular y 2- qué modificaciones producen las hormonas y concentraciones altas de histamina en la producción de VWF y ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de HUVEC. Se analizaron los efectos de las hormonas, a distintas dosis, en la proliferación o apoptosis, mediante el uso de técnicas de citometría de flujo y ensayo por colorimetría (MTS). Para evaluar el mecanismo de señalización se analizó la fosforilación de MAPK utilizando la técnica de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se observó que el efecto proliferativo del estradiol en HUVEC, ocurre a través de un aumento de la fosforilación de ERK2, inducido por el estímulo de la deprivación del suero. La progesterona y testosterona en dosis suprafisiológicas promovieron la apoptosis de HUVEC vía activación de p38 y JNK. Además se analizaron los niveles de mRNA (por Real Time PCR) y proteína intracelular y liberada (por SDS-PAGE e inmunotransferencia y ELISA) de VWF y ADAMTS13, en respuesta a los distintos tratamientos hormonales y con histamina. El estradiol, la progesterona y testosterona, no produjeron ningun cambio en la liberacion de VWF en las HUVEC, sin embargo combinadas con histamina, agonista de la liberación de VWF, produjeron inhibición de la actividad de la histamina. Por otra parte el estradiol, la progesterona y la testosterona no produjeron cambios significativos en la liberación de ADAMTS13, sin embargo el tratamiento con histamina indujo una disminución en los niveles de ADAMTS13, que fue revertida en la combinación con estradiol y progesterona. Finalmente, el estradiol, produjo un aumento en los niveles de mRNA de VWF y ADAMTS13. En la síntesis de ambos mRNA, el estradiol y la histamina presentan un efecto antagónico y la combinación de la progesterona y la histamina presentarían un efecto sinérgico.
VWF is a multimeric protein produced by endothelial cells and megakaryocytes. It is synthesized into a monomeric form, arranged into dimmers and multimers. VWF promove the platelet adhesion to the vascular subendothelium, also plays critical role in blood coagulation as it is the carrier protein for FVIII. ADAMTS13, the 13th member of the ADAMTS family of metalloprotease characterized by the combination of A disintegrin-like metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motif, is the main physiological modulator of the size of VWF in plasma. ADAMTS13 is synthesized in liver cells. Recently it has been shown that ADAMTS13 it is synthesized and stored in the EC, and it has enzymatic activity using both stationary and flow assays. ADAMTS13 impairs the physiological process of cleavage of the largest, higly thrombogenic multimers of VWF wich, when present in plasma and/or on the endothelial cell surface, lead to massive intravascular aggregation and platelet thrombus formation in the terminal circulation. We have observed that during pregnancy VWF levels increased and ADAMTS13 levels decreased. Since 1972, several authors have described the increase of 17β estradiol levels. Also, it has been observed that the treatment of EC with estradiol induced an increase in VWF,in non physiological dose. There are several reports about the sexual hormones action in different cell lines and primary cultures, either in cell death or cell proliferation. It was shown the existence of an embryonic histamine-releasing factor and a high expression of receptors for histamine during gestation in humans. In addition, there was an increase of histamine levels in the final weeks of gestation in models of golden hamsters and rats. The thesis objectives were: 1- to analyze if the hormonal changes that induce or inhibit the synthesis or release of VWF and ADAMTS13 have influence in the cell death or cell proliferation and 2- what changes are produced with hormone and high histamine levels in the production of VWF and ADAMTS13. The experiments were carried out in HUVEC cultures. The effects of different doses of hormones on the proliferation or apoptosis were analyzed by flow cytometry techniques and testing by colorimetry (MTS). The MAPK phosphorylation was tested by SDS-Page and immunoblotting to check the signal mechanism. It was noted that the proliferative effect of estradiol on HUVEC, occurred through an increase in phosphorylation of ERK2, induced by the deprivation of serum. Progesterone and testosterone promoted apoptosis, via activation of p38 and JNK, in supraphysiological doses. In addition, VWF and ADAMTS13 were analyzed by: 1- levels of mRNA (Real Time PCR) and 2- levels of intracellular VWF and ADAMTS13 and their release induced by hormonal and histamine treatments (by SDS-Page, inmunoblotting and ELISA). Estradiol, progesterone and testosterone did not produce any change in the VWF and ADAMTS13 released from HUVEC. However, when the hormones were combined with histamine (agonist for VWF release), they induced the inhibition of the histamine effect. On the other hand, the treatment with histamine produced a decrease in ADAMTS13 levels, which was reversed by the combination of histamine with estradiol and progesterone. Finally, estradiol increased mRNA levels of VWF and ADAMTS13. Estradiol and histamine had an opposite effect in the synthesis of both mRNA. The combination of progesterone and histamine present a synergistic effect.
Fil: Powazniak, Yanina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.