Relevancia del ciclo celular en la definición del destino celular durante la diferenciación de células madre embrionarias de ratón

• Autores: Waisman, Ariel
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Guberman, Alejandra Sonia
• Materia: CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; DIFERENCIACION; CICLO CELULAR; DIVISION CELULAR; REPLICACION DEL ADN; MOUSE EMBRYONIC STEM CELLS; DIFFERENTIATION; CELL CYCLE; CELL DIVISION; DNA REPLICATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celular interno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo mientras que, ante estímulos adecuados, pueden dar origen a todos los tipos celulares del organismo adulto, propiedad conocida como pluripotencia. En esta tesis, estudiamos la relación de las propiedades fundamentales de CME de ratón con diversos aspectos del ciclo celular. En primer lugar, caracterizamos en detalle la dinámica poblacional de proliferación celular, tanto en estado indiferenciado naïve como durante la salida del mismo. Demostramos que la duración de la fase G1 del ciclo celular está pre-determinada en gran medida por la célula parental. Asimismo, determinamos que durante la salida del estado indiferenciado naïve la duración total del ciclo celular, de la fase G1 y de las fases S/G2/M disminuye, en contraposición con lo que ocurre en tipos celulares más diferenciados. Por otra parte, estudiamos la relación entre los cambios transcripcionales que ocurren durante la diferenciación celular con dos procesos en los que ocurre una reconfiguración de la estructura epigenética: la replicación del ADN y la división celular. Mediante la generación de cultivos sincrónicos y un protocolo de diferenciación dirigida, mostramos que las células comienzan a modificar sus patrones de expresión génica en la misma generación que recibe la señal de diferenciación, demostrando que la división celular no es un proceso indispensable para el inicio de los cambios transcripcionales requeridos para la salida del estado indiferenciado naïve. Por otra parte, determinamos que la inhibición de la replicación del ADN reprime severamente el cambio transcripcional durante la diferenciación. Dicho bloqueo en el cambio del perfil de expresión génica fue independiente de la activación de las vías de daño al ADN, evaluado mediante la generación de una línea knock out para p53 con la tecnología de CRISPR/Cas9. Nuestros resultados sugieren que la replicación del ADN podría ser necesaria para que ocurra el cambio en los programas transcripcionales durante la salida del estado indiferenciado, indicando que la síntesis de ADN podría estar acoplada a la modificación de los patrones epigenéticos durante la diferenciación celular. Este resultado podría contribuir a una explicación mecanística para la reciente observación de que las CME sólo responden a señales de diferenciación durante la fase G1 del ciclo celular, es decir, antes de la replicación del ADN. Creemos que los resultados de este trabajo pueden contribuir al entendimiento de los procesos moleculares que controlan las propiedades fundamentales de CME, lo cual no sólo es importante dentro del área de la biología del desarrollo, sino además para su futura aplicación en el área de terapias regenerativas.
Embryonic stem cells (ESCs) are cells derived from the inner cell mass of the mammalian blastocyst. They can indefinitely self-renew in vitro while, upon certain stimuli, they can originate all the cell types of the adult organism, property known as pluripotency. In this thesis, we studied the relation between the fundamental properties of mouse ESCs (mESCs) and different aspects of the cell cycle. First, we characterized in depth the population dynamics of cell proliferation, both while maintaining the pluripotent state and during the transition to a more developmentally advanced state. We show that the G1 phase length is largely pre-determined by its parental cell. Also, we determined that the length of the total cell cycle and of the G1 and S/G2/M phases decreases as cells exit the naïve pluripotent state, contrary to what happens in more developmentally advanced cell types. On the other hand, we analyzed the relation between the changes of transcriptional profiles as cells exit naïve pluripotency with two processes in which there is a major reorganization of the structure of chromatin: DNA replication and cell division. By generating synchronized cultures of mESCs as they exit naïve pluripotency, we show that cells begin to modify their levels of gene expression within the same cell generation that received the differentiation signal. Thus, we demonstrate that cell division is not a fundamental process in order to allow new transcriptional programs as cells differentiate. Next, we determined that inhibition of DNA replication severely impairs the change of transcriptional profiles during cell differentiation. This impairment was independent of the activation of the DNA damage response pathway, as evaluated by a p53 knockout cell line obtained by the CRISPR/Cas9 technology. Our results indicate that DNA replication could be necessary for the switch in transcriptional programs during naïve pluripotency exit, suggesting that this process could be coupled to the epigenetic transformation that takes place during cell differentiation. These results could contribute to a mechanistic explanation to the observation that pluripotent stem cells only respond to differentiation signals within the G1 phase, that is, before DNA replication. We believe that the results obtained in this work contribute to the understanding of the molecular processes that control the fundamental properties of pluripotent stem cells, which not only is important in the field of developmental biology, but it is also relevant for their future application in regenerative medicine.
Fil: Waisman, Ariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.