Identificación y caracterización de nuevas CDPKs en la planta de papa. Estudio de su participación en respuesta a infección por P. Infestans. Producción de plantas de papa sobreexp...

• Autores: Fantino, Elisa Inés
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ulloa de la Serna, Rita María
• Materia: PROTEINAS QUINASAS DEPENDIENTES DE CALCIO (CDPKS); FENILALANINA AMONIO LIASA (PAL); FOSFORILACION DEPENDIENTE DE CA2; PHYTOPHTHORA INFESTANS; REGULACION TRANSCRIPCIONAL; SOLANUM TUBEROSUM; CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASES; PHENYLALANINE AMMONIA LYASE; PHYTOPHTHORA INFESTANS; PROTEIN PHOSPHORYLATION; SOLANUM TUBEROSUM; TRANSCRIPTIONAL REGULATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El calcio (Ca2+) es un segundo mensajero esencial en plantas y las quinasas de proteínas dependientes de calcio, CDPKs, son sensores/transductores del catión que seinducen/activan en respuesta a estímulos ambientales. En varias especies de plantas sedemostró la participación de CDPKs en vías de señalización que median respuestas defensivas frente al ataque por patógenos (Romeis & Herde 2014). A lo largo de la evolución, las plantas desarrollaron mecanismos de respuesta rápida ante patógenos que involucran cambios en los niveles intracelulares de Ca2+ y en el estado de fosforilación de las proteínas. Las CDPKs poseen un dominio quinasa de proteínas (KD) unido a través de una región bisagrao dominio autoinhibitorio (AD) a un dominio regulador homólogo a la calmodulina (CLD) con 4 sitios de unión al calcio (EF‐hands). En angiospermas, las CDPKs componen familiasmultigénicas de aproximadamente 30 miembros que presentan gran homología de secuenciaentre sí a excepción del dominio amino terminal variable (NTV) que regula la localizaciónsubcelular de la enzima y la especificidad de sustrato. En la planta de papa, Solanumtuberosum, nuestro grupo caracterizó tres isoformas de CDPK, StCDPK1, 2 y 3, que seexpresan durante el proceso de tuberización (Raíces et al. 2001; Raíces et al. 2003; Gargantini et al. 2009; Giammaria et al. 2011; Grandellis et al. 2012; Santin et al. 2016; Grandellis et al. 2016). Además otros tres miembros de la familia fueron caracterizados porotros grupos, StCDPK4 y 5 (Kobayashi et al. 2007), y StCPK1 (Lakatos et al. 1998). Una búsqueda bioinformática en el genoma de Solanum phureja (PGSC) mostró que la familia CDPK de papa está compuesta por 26 miembros agrupados en los 4 gruposcaracterísticos de angiospermas. El grupo I es el más expandido con 12 miembros, el II estácompuesto por 7 miembros, el III por 5 y sólo 2 miembros componen el grupo IV. Se encontraron además 3 quinasas de proteínas relacionadas con CDPK (CRKs) que se agrupanen una rama cercana al grupo IV, y una proteína CDPK-like más distante. El análisis evolutivo sugirió que CDPKs, CRKs y CDPK-like comparten un mismo origen evolutivo. El uso deherramientas bioinformáticas permitió inferir diversas características de los miembros de lafamilia, entre ellas su capacidad de miristoilarse y palmitoilarse, la presencia de péptidos señales a otras organelas y la presencia de motivos PEST. Estudios de expresión y análisis dedatos de RNAseq disponibles en la base de datos del genoma de papa permitierondeterminar que varias CDPKs presentan una expresión ubicua mientras que un tercio de susmiembros se expresa exclusivamente en órganos florales, mayoritariamente en estambres. Los datos de RNAseq también permitieron identificar CDPKs cuya expresión se induce enrespuesta a estreses bióticos. Entre estas últimas, se eligió la isoforma StCDPK7,perteneciente al grupo I, para caracterizarla en profundidad. Se clonó la secuenciacodificante que codifica una proteína de 578 aminoácidos, cuyo peso molecular es de 66 kDay presenta todos los dominios característicos de una CDPK. En su NTV se predijo, in silico, lapresencia de un péptido de tránsito a cloroplastos y de dos motivos PEST. Se estudió supatrón de expresión en tejidos por RT-qPCR, se clonó y analizó su secuencia promotora (2.273 pb) y se obtuvieron plantas promStCDPK7::GUS. Tanto la tinción histoquímica como las RT-qPCRs mostraron que la enzima se expresa mayoritariamente en raíces lo que concuerda con los elementos reguladores en cis encontrados en su región promotora. Ensayos de expresión transitoria, en hojas de Nicotiana benthamiana, de las proteína defusión, StCDPK7:YFP y StCDPK71-157:GFP, mostraron que, en condiciones estándar de cultivo, StCDPK7 presenta localización citosólica y no se encuentra asociada a cloroplastos. Paraproceder a su caracterización bioquímica y determinar sus parámetros cinéticos, se obtuvo laproteína recombinante StCDPK7 etiquetada con 6xHis. Se demostró que StCDPK7:6xHis esuna quinasa activa dependiente de Ca2+, capaz de autofosforilarse en múltiples sitios enpresencia del catión, fosforila diversos sustratos y puede usar Mn2+ o Mg2+ como cofactoresdel complejo ATP-Me2+. En ensayos de RT-qPCR se observó que la expresión de StCDPK7aumenta (3,5 veces) en hojas distales de plantas que fueron infectadas con el patógenohemibiotrófico Phythophthora infestans. Asimismo, se confirmó la inducción, en hojas inoculadas y distales de plantas infectadas, de StPR-1b, gen asociado a la patogénesis y de StPAL1 que codifica una fenilalanina amonio liasa. Se demostró que StCDPK7:6xHis fosforilaen forma específica a cuatro proteínas NtPAL de tabaco que presentan un alto grado dehomología con las enzimas de papa. Finalmente, se produjeron plantas que sobrexpresan la proteína StCDPK7 (35S::StCDPK7:6xHis) como una primera aproximación funcional paradeterminar si esta isoforma interviene en la respuesta de la planta a estreses bióticos. Undato llamativo fue que los niveles del transcripto StPAL1 disminuyeron en estas plantas. La papa es el tercer cultivo alimenticio luego del arroz y del trigo (FAOSTAT, 2009). El oomycete P. infestans, causante del tizón tardío de la papa, ocasiona cuantiosos daños al cultivo encondiciones de alta humedad y bajas temperaturas. Por el momento la única solución para el manejo de la enfermedad es el uso de agroquímicos. Una variante es la generación deplantas resistentes. Es necesario completar la caracterización de las líneas 35S::StCDPK7:6xHis y realizar los ensayos de infección con P. infestans en estas plantas, para determinar si la manipulación biotecnológica de StCDPK7 puede conferir resistencia al oomycete.
Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) decode calcium (Ca2+) signals and activatedifferent signaling pathways involved in hormone signaling, plant growth, development, andboth abiotic and biotic stress responses. In this study, we describe the potato CDPK/CRKmultigene family; bioinformatic analysis allowed us to identify twenty six CDPK isoforms,three CDPK-related kinases (CRKs) and a CDPK-like kinase. Phylogenetic analysis indicatedthat the twenty-six StCDPKs can be classified into four groups, whose members are predictedto undergo different acylation patterns and exhibited diverse expression levels in differenttissues and in response to various stimuli. With the aim of characterizing those membersthat are particularly involved in plant-pathogen interaction, we focused on StCDPK7. StCDPK7 encodes a 66 kDa protein that presents all the characteristic domains of CDPKs. Prediction programs inferred that it harbors a chloroplast transit peptide in its NTV and two PEST motifs. Transient expression assays performed with StCDPK7:YFP or StCDPK71-157:GFPfusion proteins showed that StCDPK7 displays a cytosolic/nuclear localization in spite ofhaving a predicted chloroplast transit peptide. StCDPK7 promoter region (2,273 bp) wascloned and analyzed, and promStCDPK7::GUS plants were generated. Histochemical analysisdetected GUS activity in the tips and initiation points of lateral roots and in adventitiousroots. Tissue expression profile revealed that StCDPK7 transcript levels are high in swollenstolons, roots, and mini tubers correlating with the cis-elements identified in its promoter. Moreover, its expression is induced upon Phytophthora infestans infection in systemic leavestogether with StPR-1b and StPAL1. The recombinant protein, StCDPK7:6xHis, is an active Ca2+ -dependent protein kinase that can phosphorylate four tobacco isoforms ofphenylalanine ammonia lyase, an enzyme involved in plant defense responses. The analysisof the potato CDPK family provides the first step towards the identification of CDPK isoformsinvolved in biotic stress and StCDPK7 emerges as a relevant player that could be manipulatedin order to deploy disease resistance in potato crops. StCDPK7 overexpressing lines wereobtained. Preliminar data indicate that in S35::StCDPK7:6xHis lines, StPAL1 transcripts arereduced, however, upon infection with P. infestans, PAL expression is induced. Futureexperiments should be performed in order to determine the role of StCDPK7 in potato - P.infestans interaction.
Fil: Fantino, Elisa Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.