Desarrollo de estrategias biotecnológicas para aumentar la tolerancia en la planta de papa frente a salinidad, sequía y a la infección por Phytophthora infestans

• Autores: Grossi, Cecilia Eugenia María
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ulloa de la Serna, Rita María
• Materia: SALINIDAD; SEQUIA; PHYTOPHTHORA INFESTANS; QUINASAS DE PROTEINAS DEPENDIENTES DE CALCIO (CDPK); PLANTAS TRANSGENICAS DE PAPA; METHYLOBACTERIUM; RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL (PGPR); SALINITY; PHYTOPHTHORA INFESTANS; CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASES (CDPKs); POTATO TRANSGENIC PLANTS; METHYLOBACTERIUM; PLANT GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA (PGPR)
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La producción mundial de alimentos debe incrementarse en un 70% para satisfacer las demandas alimenticias de la población en 2050. Sin embargo, factores abióticos, entre ellos la salinidad y la escasez de agua y factores bióticos (patógenos y plagas) limitan de forma severa la productividad de las plantas. En este contexto, se requieren innovaciones tecnológicas para mejorar la producción de cultivos. En la presente tesis doctoral se abordaron dos estrategias biotecnológicas para hacer frente a limitaciones abióticas y bióticas del cultivo de papa. Por un lado, se generaron plantas transgénicas que sobreexpresan la quinasa de proteínas dependiente de calcio StCDPK2 (35S:StCDPK2), y por otro se probó la inoculación de una rizobacteria promotora del crecimiento vegetal (PGPR). Las CDPKs son sensores-transductores que decodifican las firmas de Ca2+ desencadenadas por estímulos y las transducen en respuestas fisiológicas. El promotor de la isoforma StCDPK2 contiene numerosos sitios de respuesta a estrés; la actividad GUS aumentó en plantas de papa ProStCDPK2:GUS expuestas a 150 mM NaCl o manitol y la expresión de StCDPK2 se indujo en plantas WT tratadas con alta sal por lo que se propuso evaluar si su sobreexpresión podía tener un efecto positivo frente a la salinidad. Los datos biométricos, de contenido de clorofila, contenido de peróxido y de actividad catalasa indicaron que las plantas 35S:StCDPK2 fueron más tolerantes que las plantas WT en ensayos in vitro en presencia de sal (50 mM NaCl). En condiciones control, las líneas 35S:StCDPK2 presentaron mayor expresión de los factores de transcripción WRKY6 y ERF5 que se inducen en respuesta a sal. Las plantas 35S:StCDPK2 cultivadas en invernadero presentaron mayor contenido de clorofila y produjeron tubérculos más grandes que las WT al estar sometidas a una CE de 9-10 dS/m. Al ser expuestas a sequía, las sobreexpresantes tuvieron un mejor desempeño que las WT y al regarse se recuperaron más rápidamente, pero al finalizar el ensayo la sobrevida y el rendimiento en tubérculos fue similar. El análisis de los datos obtenidos hasta el momento indicó que la sobreexpresión de StCDPK2 no confiere mayor resistencia o tolerancia a la infección por el oomiceto Phytophthora infestans. Además, se aisló un bacilo gran negativo (denominado 2A) a partir de plantas de papa cultivadas in vitro que mostraban una coloración rosada en la superficie de las raíces. Estas plantas presentaban mayor densidad de pelos radiculares y mayor biomasa que otras líneas de papa de la misma edad. La secuencia de ADN ribosomal 16S, indicó que el aislamiento 2A pertenece al género Methylobacterium. La secuenciación del genoma completo reveló vías metabólicas asociadas con su capacidad promotora del crecimiento vegetal, entre ellas dos rutas de biosíntesis de ácido indol acético (AIA). La identidad de nucleótidos entre el genoma de Methylobacterium sp. 2A y otros miembros del género sugiere que esta especie no fue descrita hasta el momento. Methylobacterium sp. 2A solubiliza fosfato mineral, puede crecer en un medio libre de N₂ y produce altos niveles de AIA. Su inoculación en plantas DR5:GUS de tomate y de Arabidopsis indujo la actividad GUS y, en la mutante iaa19 incrementó (44%) la formación de raíces laterales. Plantas de Arabidopsis WT inoculadas con Methylobacterium sp. 2A cultivadas en condiciones control o de estrés salino (75 mM NaCl), mostraron una mayor densidad de raíces laterales que las plantas no inoculadas. Además, bajo estrés salino, presentaron mayor número de hojas y mayor diámetro de roseta. A su vez, in vitro, las plantas de papa inoculadas con Methylobacterium sp. 2A tuvieron un mejor rendimiento cuando se crecieron en NaCl (50 mM). En ensayos de confrontación dual en placa, Methylobacterium sp. 2A mostró actividad de control biológico contra P. infestans, Botrytis cinerea y Fusarium graminearum. En ensayos de infección con P. infestans realizados en plantas de papa de invernadero que fueron previamente inoculadas o no con Methylobacterium sp. 2A, el tamaño de las lesiones necróticas y la clorosis fue significativamente menor en las plantas inoculadas. Nuestros resultados sugieren que ambas estrategias biotecnológicas pueden mejorar el rendimiento del cultivo de papa: StCDPK2 es un actor temprano en la respuesta al estrés salino y existe una correlación positiva entre su sobreexpresión y la tolerancia a la salinidad y la sequía. Por otra parte, Methylobacterium sp. 2A es una rizobacteria promotora del crecimiento vegetal (PGPR) que alivia el estrés salino y restringe la infección por P. infestans.
Global food production needs to be increased by 70% to meet population food demands by 2050. However, abiotic factors such as salinity and water scarcity, and biotic factors (pathogens and pests) severely limit plant productivity. In this context, novel agricultural technologies are required to improve food production. In this PhD thesis, two biotechnological strategies were developed to face the abiotic and biotic limitations of potato culture. For this, transgenic plants that overexpress the calcium-dependent protein kinase StCDPK2 (35S:StCDPK2) were generated. Furthermore, the inoculation of a plant growth-promoting rhizobacterium (PGPR) was tested. CDPKs are sensor-transducers that decode stimulus-triggered Ca2+ signatures and transduce them into physiological responses. StCDPK2 promoter contains numerous stress-responsive sites; GUS activity increased in ProStCDPK2:GUS potato plants exposed to 150 mM NaCl or mannitol and the expression of StCDPK2 was induced in WT plants treated with high salt, therefore it was proposed to evaluate whether its overexpression could have a positive effect against salinity. Biometric data, chlorophyll content, peroxide content, and catalase activity indicated that 35S:StCDPK2 plants were more tolerant than WT plants in the presence of salt (50 mM NaCl) in in vitro assays. Under control conditions, 35S:StCDPK2 lines showed higher expression of WRKY6 and ERF5 transcription factors which are induced in response to salt. 35S:StCDPK2 plants grown in the greenhouse presented higher chlorophyll content and produced bigger tubers than the WT when subjected to an EC of 9-10 dS/m. When exposed to drought, the overexpressing plants had a better performance than the WT and they recovered more quickly after rewatering, but survival and tuber yield were similar at the end of the assay. Analysis of the obtained data indicated that StCDPK2 overexpression does not confer greater resistance or tolerance upon infection with the oomycete Phytophthora infestans. In addition, a Gram-negative pink-pigmented bacillus (named 2A) was isolated from potato plants grown in vitro that showed a pink pigmentation on the surface of the roots. These plants presented increased root hair density and higher biomass than other potato lines of the same age. The 16S ribosomal DNA sequence indicated that strain 2A belongs to the genus Methylobacterium. Whole-genome sequencing revealed metabolic pathways associated with its plant growth-promoting ability, including two indole acetic acid (IAA) biosynthesis pathways. Nucleotide identity between Methylobacterium sp. 2A sequenced genome and the rest of the species that belong to the genus suggested that this species has not been described so far. Methylobacterium sp. 2A solubilizes mineral phosphate, can grow in N₂-free medium and produces high levels of IAA. Upon inoculation, GUS activity was induced in the roots of DR5:GUS tomato and Arabidopsis plants, and lateral root formation was improved in iaa19 plants (44%). Arabidopsis WT plants inoculated with Methylobacterium sp. 2A grown under control or saline stress conditions (75 mM NaCl) displayed a higher density of lateral roots than non-inoculated plants. Moreover, under salt stress, they presented a higher number of leaves and larger rosette diameter. In turn, in vitro potato plants inoculated with Methylobacterium sp. 2A had a better performance when grown under 50 mM NaCl. In dual confrontation assays, Methylobacterium sp. 2A displayed biological control activity against P. infestans, Botrytis cinerea, and Fusarium graminearum. In addition, we observed that Methylobacterium sp. 2A diminished the size of necrotic lesions and reduced chlorosis when greenhouse potato plants were infected with P. infestans. Our results suggest that both biotechnological strategies can improve potato crop yield: StCDPK2 is an early player in the salt-stress response and there is a positive correlation between its overexpression and the tolerance towards salt and drought stress. On the other hand, Methylobacterium sp. 2A is a plant growth promoting rhizobacterium (PGPR) that alleviates salt stress and restricts P. infestans infection.
Fil: Grossi, Cecilia Eugenia María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.