Estudios sobre el proceso de regulación reductiva de la Fructosa-1,6-Bisfostasa cloroplastídica de colza (Brassica napus)

• Autores: Rodríguez Suárez, Roberto J.
• Año de publicación: 1998
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Wolosiuk, Ricardo Alejandro
• Materia: BISFOSFATASA; CLOROPLASTO; REGULACION REDUCTIVA; CICLO DE CALVIN; BRASSICA; BISPHOSPHATASE; CHLOROPLAST; REDUCTIVE REGULATION; CALVIN CYCLE; BRASSICA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En las plantas, la Fructosa-1,6-Bisfosfatasa de cloroplastos (CFBPase) cataliza la defosforilación irreversible de la fructosa-1,6-fosfato en el ciclo de Benson-Calvin. La CFBPase es una enzima clave en la regulación de la asimilación del C02 y su actividad específica es fuertemente regulada por luz, a través de una cascada reductiva vía Tiorredoxina. Los principales objetivos fueron: i) obtener una CFBPase recombinante útil como modelo de la contrapartecloroplastídica,ii) empleando mutagénesis sitio-dirigida, caracterizar el rol de las cist(e)inas en suestabilidad estructural, modulación y actividad catalítica,iii) analizar la multiplicidad de loci para la CFBPase en el alotetraploide B.napus y ensus parentales diploides B.campestris y B.oleracea. Construímos una cDNA library de expresión de hojas de colza y obtuvimos varios clones codificando la CFBPase. Luego expresamos y purificamos de E.coli la proteína recombinante, que mostró alta actividad enzimática. Su caracterización estructural y funcional estableció que es virtualmente idéntica a la contraparte cloroplastídica. Preparamos varias mutantes sitio-dirigidas por reemplazo de cisteínas diferencialmente afectadas en sus propiedades regulatorias, algunas de las cuales resultaron parcial o constitutivamente activadas. Determinamos que la Cys157 es crítica y que las Cysl74 y 179 también son participantes de la modulación reductiva. Proponemos un mecanismo que involucra tres residuos Cys, y donde se requiere laformación de diferentes disulfuros en las distintas subunidades del homotetrámero. Laactividad catalítica no disminuyó por el reemplazo de ninguna de las siete Cys de laenzima. También encontramos que existen al menos dos loci por complemento haploidepara la CFBPase en B.napus y en sus parentales B.oleracea y B.campestris. Ambos loci seexpresan en hojas verdes y las enzimas recombinantes poseen actividades muy similares. En conjunto, estos análisis podrían tener un elevado impacto en los estudiosorientados a manipular la velocidad de asimilación de C02 y la partición "fuente/sumidero” del fotosintato en una especie económicamente importante como lacolza.
In plants, CFBPase catalyses the irreversible dephosphorylation of fructose 1,6-bisphosphatein the Benson-Calvin Cycle. This enzyme is a key regulator of C02assimilation rate and its specific activity is strongly modulated by light through areductive cascade via Thioredoxin. The main goals were to, i) obtain a recombinant CFBPase suitable as a model of the plastidic counterpart,ii) using site-directed mutagenesis, characterise the role that cyst(e)ines play in itsstructural stability, activation and catalytic processes,iii) analyse the multiplicity of loci for the CFBPase in the allotetraploid B.napus andits parental diploids B.campestris and B.oleracea. We constructed a cDNA expression library from rapeseed leaves and obtainedseveral clones coding for the CFBPase. We expressed and purified from E.coli therecombinant protein who evinced high enzymatic activity. Its kinetic and structuralcharacterisation showed that it was almost identical to the plastidic counterpart. We prepared several site-directed cysteine replacement mutants differentlyaffected in their regulatory properties, some of which were partially or constitutivelyactivated. We determined that Cys157 is critical, and Cysl74 and Cysl79 are alsoparticipants in the reductive modulation. A novel mechanism involving three Cysresidues, where the formation of mixed disulphides in distinct subunits of the enzymetetramer are likely required, is suggested. None of the seven Cys residues were essentialfor the catalytic activity of CFBPase. We also found the occurrence of at least two loci per haploid genome coding forthe CFBPase in B.napus, and its parental species B.oleracea and B.campestris. Both lociare expressed in green leaves and the recombinant enzymes behave very similarly. Taken together, these analysis would have a large impact in the manipulation of C02 fixation rate and source-sink photosynthate partition in economically importantspecies such as rapeseed.
Fil: Rodríguez Suárez, Roberto J.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.