Estudios sobre el proceso de regulación reductiva de la Fructosa-1,6-Bisfostasa cloroplastídica de colza (Brassica napus) - Rodríguez Suárez, Roberto J. (1998)
En las plantas, la Fructosa-1,6-Bisfosfatasa de cloroplastos (CFBPase) cataliza la defosforilación irreversible de la fructosa-1,6-fosfato en el ciclo de Benson-Calvin. La CFBPase es una enzima clave en la regulación de la asimilación del C02 y su actividad específica es fuertemente regulada por luz, a través de una cascada reductiva vía Tiorredoxina. Los principales objetivos fueron: i) obtener una CFBPase recombinante útil como modelo de la contrapartecloroplastídica,ii) empleando mutagénesis sitio-dirigida, caracterizar el rol de las cist(e)inas en suestabilidad estructural, modulación y actividad catalítica,iii) analizar la multiplicidad de loci para la CFBPase en el alotetraploide B.napus y ensus parentales diploides B.campestris y B.oleracea. Construímos una cDNA library de expresión de hojas de colza y obtuvimos varios clones codificando la CFBPase. Luego expresamos y purificamos de E.coli la proteína recombinante, que mostró alta actividad enzimática. Su caracterización estructural y funcional estableció que es virtualmente idéntica a la contraparte cloroplastídica. Preparamos varias mutantes sitio-dirigidas por reemplazo de cisteínas diferencialmente afectadas en sus propiedades regulatorias, algunas de las cuales resultaron parcial o constitutivamente activadas. Determinamos que la Cys157 es crítica y que las Cysl74 y 179 también son participantes de la modulación reductiva. Proponemos un mecanismo que involucra tres residuos Cys, y donde se requiere laformación de diferentes disulfuros en las distintas subunidades del homotetrámero. Laactividad catalítica no disminuyó por el reemplazo de ninguna de las siete Cys de laenzima. También encontramos que existen al menos dos loci por complemento haploidepara la CFBPase en B.napus y en sus parentales B.oleracea y B.campestris. Ambos loci seexpresan en hojas verdes y las enzimas recombinantes poseen actividades muy similares. En conjunto, estos análisis podrían tener un elevado impacto en los estudiosorientados a manipular la velocidad de asimilación de C02 y la partición "fuente/sumidero” del fotosintato en una especie económicamente importante como lacolza.