Epidemiología molecular y genómica comparativa de Leptospira spp. en Argentina

• Autores: Varni, Vanina Delia
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Caimi, Karina Cynthia; Ruybal, Paula
• Materia: LEPTOSPIRA; EPIDEMIOLOGIA; MULTILOCUS SEQUENCE TYPING; SEROGRUPOS; GENOTIPOS; DIVERSIDAD GENETICA; LEPTOSPIRA; EPIDEMIOLOGY; MULTILOCUS SEQUENCE TYPING; SEROGROUPS; GENOTYPES; GENETIC DIVERSITY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Leptospira y constituye unazoonosis de amplia distribución mundial. La enfermedad puede ser contraída a través del contacto conambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la principal vía de transmisión es el agua. Los brotes de leptospirosis en Argentina están asociados a cambios climáticos y en particular ainundaciones. A pesar de ello, en nuestro país existe escasa información de la situación epidemiológicaactual de la enfermedad, principalmente debido a la subnotificación de casos y a su persistencia de tipoendémico en los animales. En los últimos años se han reforzado los análisis tendientes al conocimiento epidemiológico de estaenfermedad. En el campo de la epidemiología molecular, se desarrollaron distintos enfoques basados en PCR para la identificación y tipificación de aislamientos de Leptospira, siendo las más utilizadas: MLVA (análisis de VNTRs en múltiples loci) y MLST (tipificación por secuenciación de múltiples loci). Ambastecnologías se basan en la amplificación por PCR, con la diferencia de que en el primer caso se trata deelementos de tipo minisatélite (unidades repetitivas en un rango de 8 a 100 pares de bases) y en el segundocaso los blancos de amplificación constituyen fragmentos de genes conservados o housekeeping que sonsecuenciados para su posterior análisis. Esta última se ha convertido en una técnica líder entre los métodosde tipificación molecular, debido a su alto poder discriminatorio entre distintos aislamientos bacterianos, sufácil aplicación y estandarización, además de la posibilidad de transmitir la información obtenida endistintos laboratorios a través de bases de datos públicas. Asimismo, las secuencias génicas obtenidas sonaplicables a estudios poblacionales y epidemiológicos. En este trabajo se evaluaron y desarrollaron los principales métodos para la tipificación de Leptospira; laevaluación y aplicación de las técnicas MLVA y MLST permitieron identificar genotipos circulantes demanera mayoritaria entre aislamientos argentinos, tanto provenientes de animales de producción como enhumanos. Se logró generar un nuevo esquema de MLST (7LA) para leptospiras patógenas a partir de lacombinación de dos esquemas existentes, optimizando y unificando la metodología de tipificación. Lassecuencias génicas generadas en este trabajo se encuentran publicadas en una base de datos disponible eninternet (http://pubmlst.org/leptospira/), donde además de acceder a las mismas, puede aplicarse lametodología para la determinación de genotipos a partir de nuevos aislamientos, posibilitando lacomparación de cepas a nivel mundial. El nuevo esquema se aplicó no solamente a los aislamientosargentinos, sino que se utilizó en la tipificación in silico a partir de 283 secuencias genómicas deaislamientos y cepas de referencias mundiales que fueron generadas en el marco de un proyecto desecuenciación genómica de este género. Se establecieron 199 genotipos diferentes donde el perfil de MLSTdenominado ST47 agrupó el 34 % de los aislamientos estudiados, similarmente a lo ocurrido para lasmuestras argentinas. Como consecuencia de los análisis filogenéticos y de formación de complejos clonales, se logró estableceruna correlación entre genotipos y serogrupos al que pertenecen los aislamientos, aportando de estamanera una alternativa complementaria al diagnóstico serológico actual. En este sentido, se logró tambiénla generación de un esquema de MLST reducido utilizando tan sólo tres de los siete marcadores delesquema 7LA. El esquema reducido (3LA) permitió la tipificación molecular directamente a partir demuestras clínicas, sin necesidad de contar con el aislamiento, que muchas veces es sumamente difícil delograr debido a las características propias de esta bacteria. Este trabajo permitió entonces profundizar en el conocimiento de la variabilidad genética del género Leptospira y así generar información epidemiológica adecuada que pueda ser utilizada en programas decontrol y métodos de diagnóstico de esta enfermedad, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizadoen nuestro país.
Leptospirosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Leptospira, and constitutes a zoonosisof worldwide distribution. The water becomes the main route of transmission when it is contaminated bythe urine of infected animals. The outbreaks of leptospirosis in Argentina are associated to climate changesand particularly to the occurrence of floods. However, there is little information on the currentepidemiological situation of the disease in our country, mainly due to underreported cases and thepersistence of endemicity in animals. Recently, epidemiological analyses have strengthened the understanding of this disease. In the field ofmolecular epidemiology, PCR-based approaches for the identification and typing of isolates of Leptospirahave been developed. Currently, the most frequently used approaches are MLVA (Multiple Locus VNTRs Analysis) and MLST (Multilocus Sequence Typing). Both technologies are based on PCR amplification. However, for MLVA the amplification targets are minisatellite elements (repeats in a range of 8 to 100 basepairs), whereas MLST targets fragments of housekeeping genes that are sequenced for further analysis. MLST has become a leading technique among the molecular typing methods, because of its highdiscriminatory power between different bacterial isolates, easy application and standardization, plus theability to share information obtained in different laboratories through public databases. Besides, the genesequences generated by this method area applicable to population and epidemiological studies. In this work, we evaluated and developed the main methods for typing Leptospira. The implementation of MLVA and MLST techniques led to the identification of major genotypes circulating among Argentineisolates from both livestock and humans. A new MLST scheme (7LA) was generated for pathogenicleptospires by optimizing and unifying two pre-existing MLST strategies. The gene sequences generatedthrough this work have been published in a database available online (http://pubmlst.org/leptospira/). Themethodology can also be applied for the genotyping of new isolates, enabling the comparison of genotypesworldwide. In addition, the new scheme was applied not only to Argentine isolates, but was used in silicofor the characterization of 283 genomic sequences of isolates and strains of global distribution, which weregenerated as part of a genome sequencing project dedicated to this genus. A total of 199 differentgenotypes were established, and the MLST allelic profile named ST47 grouped 34% of the studied isolates,in agreement with the previous studies on Argentine samples. As a result of the phylogenetic and clonal complexes analyses, we could establish a correlation betweengenotypes and serogroups, thus providing a complementary alternative to the current serological diagnosis. In this regard, the generation of a reduced MLST scheme was also achieved, by selecting only three of theseven markers from the 7LA scheme. The reduced MLST scheme (3LA) was applied to the molecular typingfrom clinical sample without the need of isolation, which is often difficult to achieve because of theparticular characteristics of this bacterium. In summary, this work allowed us to deepen the understanding of the genetic variability of the genus Leptospira, thus contributing with suitable epidemiologic information useful to apply in the design ofcontrol strategies and also diagnostic methods for this illness. Thus, this study constitutes the first work ofits kind conducted in our country.
Fil: Varni, Vanina Delia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.