Estudio de la regulación del citoesqueleto en la capacitación de espermatozoides murinos

• Autores: Schiavi Ehrenhaus, Liza Jamaica
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Buffone, Mariano Gabriel; Luque, Guillermina María
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los espermatozoides (spz) de mamíferos dependen de diferentes componentes del citoesqueleto para adquirir su capacidad fecundante. Actualmente, está bien establecido que el axonema, una estructura de microtúbulos de TUBULINA que recorre el flagelo espermático, es el sistema que les proporciona la motilidad necesaria para llegar al sitio de fecundación. Por otro lado, se ha demostrado que la dinámica del citoesqueleto de ACTINA es una pieza fundamental en la modulación de la exocitosis acrosomal (EA). Sin embargo, queda mucho por dilucidar sobre los mecanismos específicos a través de los cuales estasestructuras de ACTINA y TUBULINA se modifican e interactúan con las diferentes vías de señalización que rigen la capacitación de los spz. El objetivo general de este trabajo es estudiar el papel y la regulación de los diferentes componentes del citoesqueleto en la capacitación de los spz murinos. Se proponen los siguientes objetivos específicos: 1) estudiar las vías de transducción de señales involucradas en la modulación del citoesqueleto de ACTINA asociado con la EA (capítulo 1); y 2) caracterizar a la TUBULINA soluble en detergentes y dilucidar su papel en la fisiología de los spz (capítulo 2). En el primer capítulo, demostramos que la vía de señalización de las pequeñas GTPasas de la familia Rho son factores claves en la regulación temporal de los procesos que desencadenan la polimerización de ACTINA asociada a la capacitación, así como el desarrollo de la EA. Observamos que la actividad despolimerizante de COFILIN, una conocida proteína de unión a ACTINA de esta vía es regulada por una acción coordinada entre PAK4 y SSH1. La disrupción de la fosforilación de COFILIN, conduce a la inhibición de la polimerización de ACTINA y consecuentemente a una marcada caída en los niveles de EA. Asimismo, reportamos que la actividad de SSH1 está regulada por la doble acción de la actividad de RHOA/C y RAC1 y por la actividad de fosfatasas sensibles al ácido okadaico. Esta regulación es independiente de los mecanismos activadores comúnmente observados y emerge como una nueva modulación finamente ajustada que, hasta ahora, se observa exclusivamente en los spz de ratón. En conjunto, estos resultados suman nuevos elementos a la vía de las pequeñas GTPasas de la familia Rho, crucial en la modulación de la dinámica de ACTINA necesaria para la EA. El segundo capítulo de esta tesis se centra en el estudio de una nueva fracción de TUBULINA cuyo comportamiento químico se asemeja a la TUBULINA no polimerizada. Encontramos que la cantidad de TUBULINA en esta fracción depende de la capacitación, en particular de la activación de la adenilato ciclasa soluble y la presencia de Ca2+ en el medio de incubación. La cantidad de TUBULINA en la fracción soluble de spz CATSPER1 knockout (CATSPER1 KO), fue significativamente menor que en los spz control. Diferentes técnicas de microscopía de súper-resolución revelaron que la TUBULINA se encuentra principalmente confinada a la región del axonema. Sumado a esto, a pesar de que los spz CATSPER1 KO conservan el axonema, presentaron diferencias en el diámetro y organización de la misma. Estos resultados sugieren que la TUBULINA soluble podría estar formando una estructura alrededor del axonema. Finalmente, experimentos de espectrometría de masas revelaron la presencia de modificaciones post-traduccionales e isoformas de TUBULINA exclusivas de esta fracción, así como un interactoma enriquecido en proteínas involucradas en vías metabólicas. En conjunto, nuestros resultados sugieren que existe una pequeña fracción de TUBULINA libre en spz murinos, localizada en la región del axonema, con características específicas y un interactoma único, que podría desempeñar un papel regulador en la fisiología de los spz. Esta tesis subraya la importancia del citoesqueleto del spz en su fisiología y revela nuevas perspectivas sobre sus características estructurales, abriendo el camino para investigaciones futuras en el campo.
Mammalian sperm (spz) rely on different components of the cytoskeleton to acquire their fertilizing capacity. It is now well-established that the axoneme, a microtubule structure composed of TUBULIN that runs along the sperm flagellum, is the system providing them with the necessary motility to reach the fertilization site. On the other hand, it has been demonstrated that the dynamics of the ACTIN cytoskeleton play a fundamental role in modulating acrosomal exocytosis (AE). However, the specific mechanisms by which these ACTIN and TUBULIN structures are modified and interact with different signaling pathways that govern sperm capacitation are yet to be fully understood. The general objective of this work is to study the role and regulation of different cytoskeletal components in murine sperm capacitation. The following specific objectives are proposed: 1) to study the signal transduction pathways involved in modulating ACTIN cytoskeleton associated with AE (Chapter 1); and 2) to characterize detergent-soluble TUBULIN and elucidate its role in sperm physiology (Chapter 2). In the first chapter, we demonstrate that the signaling pathway of small GTPases from the Rho family are key factors in the temporal regulation of processes that trigger capacitation-associated ACTIN polymerization, as well as the development of AE. We observed that the depolymerizing activity of COFILIN, a known ACTIN-binding protein in this pathway, is regulated by coordinated action between PAK4 and SSH1. Disruption of COFILIN phosphorylation leads to inhibition of ACTIN polymerization and consequently to a marked decrease in AE levels. Additionally, we report that SSH1 activity is regulated by the dual action of RHOA/C and RAC1 activity and by okadaic acid-sensitive phosphatase activity. This regulation is independent of commonly observed activating mechanisms and emerges as a finely tuned modulation that, until now, is exclusively observed in mouse sperm. Taken together, these results add new elements to the Rho family small GTPase pathway, crucial in modulating ACTIN dynamics necessary for AE. The second chapter of this thesis focuses on the study of a new fraction of TUBULIN whose chemical behavior resembles that of unpolymerized TUBULIN. We found that the amount of TUBULIN in this fraction depends on capacitation, particularly on the activation of soluble adenylate cyclase and the presence of Ca2+ in the incubation medium. The amount of TUBULIN in the soluble fraction of CATSPER1 knockout (CATSPER1 KO) sperm was significantly lower than in control sperm. Various super-resolution microscopy techniques revealed that TUBULIN is predominantly confined to the axoneme region. In addition, although CATSPER1 KO sperm conserve the axoneme, they exhibited differences in TUBULIN diameter and organization. These results suggest that soluble TUBULIN may be forming a structure around the axoneme. Finally, mass spectrometry experiments revealed the presence of post-translational modifications and TUBULIN isotypes exclusive to this fraction, as well as an interactome enriched in proteins involved in metabolic pathways. Together, our results suggest the existence of a small fraction of free TUBULIN in mouse sperm, localized in the axoneme region, with specific characteristics and a unique interactome, which could play a regulatory role in sperm physiology. This thesis emphasizes the importance of the sperm cytoskeleton in its physiology and reveals new perspectives on its structural characteristics, paving the way for future research in the field.
Fil: Schiavi Ehrenhaus, Liza Jamaica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.