Reconocimiento de un antígeno de ADN por su anticuerpo específico : integración mecanística, termodinámica y estructural

• Autores: Sanguineti, Santiago
• Año de publicación: 2007
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: de Prat Gay, Gonzalo
• Materia: ESTRUCTURA; ANTICUERPO; UNION ADN; TERMODINAMICA; CINETICA; STRUCTURE; ANTIBODY; DNA BINDING; THERMODYNAMIC; KINETIC
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El reconocimento antígeno-anticuerpo se basa en identificación de estructuras químicas de agentes foráneos como no-propias. El ADN suele ser escasamente inmunogénico dada su similitud química y estructural entre los distintos organismos. Sin embargo, los anticuerpos anti-ADN son un razgo característico de enfermedades autoinmunes como el Lupus Eritematoso Sistémico. El anticuerpo monoclonal anti-ADN ED-10 fue aislado en nuestro laboratorio a partir de la inmunización de ratones normales, con un complejo formado por el domino carboxilo terminal del factor de transcripción E2 (E2c) del virus de papiloma humano cepa 16 (HPV16) unido a su oligonucleótido blanco. En este trabajo de tesis se describe el mecanismo de interacción de ED-10 con el ADN, el primer complejo entre un anticuerpo monoclonal y el ADN que lo generó, a través de una caracterización estructural, termodinámica y cinética. Se determinó que el anticuerpo monoclonal ED-10 reconoce solamente una de las hebras del ADN doble cadena utilizado en el complejo inmunogénico. Por otra parte, se cristalizó el fragmento Fab de este anticuerpo formando un complejo con ADN inmunógeno, siendo el primer complejo anticuerpo:ADN genuino descripto al detalle atómico a la fecha. Se realizó la caracterización termodinámica y cinética de la interacción de ED-10 con el ADN inmunógeno y con oligonucleótidos de poli-Timidina. Los primeros experimentos de calorimetría demostraron que la interacción ED-10-ADN esta entálpicamente dirigida, tiene una componente entrópica desfavorable y un cambio de capacidad calorífica negativo. Los estudios cinéticos demostraron que, la asociación entre ED-10 y el ADN presenta solo una fase cinética, con una constante de asociación aproximándose al límite de velocidad descripta para interacciones anticuerpo:antígeno. La presencia de una constante de disociación cinética extremadamente lenta resultó determinante en la formación de este complejo tan estable. Por último, se demostró que ED-10 posee actividad nucleasa, aparentemete no específica, degradando ADN doble cadena tanto en forma lineal como circular.
Antigen recognition by antibodies is based on the identification of foreign agents chemical structures as “non-self” . The DNA is barely immunogenic due to its chemical and structural similarity among the different organisms. The Systemic Lupus Erythematosus is an autoimmune disease whose main characteristic is the presence of antibodies directed against nuclear components, such as histones and DNA. The monoclonal anti-DNA antibody ED-10 was isolated in our laboratory from normal mice immunized with a complex formed by the carboxi-terminal domain of the E2 transcription factor (E2c) of the human papillomavirus 16 (HPV16) bound to it’s DNA target. In this thesis the mechanism of interaction of ED-10 with the DNA through a structural, thermodynamic and kinetic characterization is described.In addition it was determined that monoclonal antibody ED-10 recognizes only one of the strands of the double chain DNA used as immunogen in the complex. The Fab fragment of this antibody was crystallized forming a complex with DNA. This structure represents the first bona fide antibody-DNA immunogen complex described at atomic detail. The thermodynamic and kinetic characterization of the interaction of ED-10 with its immunogen DNA and with polytimidine oligonucleotides was performed. The first calorimetry experiments demonstrated that the ED-10-ADN interaction is enthalpically driven, it has an unfavorable entropic component and a negative change of heat capacity. The kinetic studies demonstrated that the association between ED-10 and DNA displays an association rate constant in the speed limit for antibody:antigen interactions. The presence of a very slow dissociation rate was decisive in the formation of a very stable complex. Finally, it was demonstrated that ED-10 has nuclease activity, apparentely non specific, degrading both linear and circular double strand DNA.
Fil: Sanguineti, Santiago. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.