Efectos y mecanismos subyacentes de la terapia génica con el sistema suicida citosina deaminasa/5-fluorocitosina en melanoma espontáneo canino

• Autores: Allende, Jesica Beatriz
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Glikin, Gerardo Claudio; Finocchiaro, Liliana M. E.
• Materia: SISTEMA SUICIDA Ycd::Yuprt/5-FC; LIPOFECCION; EFECTO BYSTANDER; ESFEROIDES; COLONIAS; APOPTOSIS; SENESCENCIA; MEDIO CONDICIONADO; Ycd::Yuprt/5-FC SUICIDE SYSTEM; LIPOFECTION; BYSTANDER EFFECT; SPHEROIDS; COLONIES; APOPTOSIS; SENESCENCE; CONDITIONED MEDIUM
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Independientemente de su origen, el melanoma comparte similitudes biológicas en todas las especies. El melanoma espontáneo canino es un tumor altamente maligno, metastásico y letal que se caracteriza por su rápido crecimiento, invasión local y metástasis temprana. Como estudio preclínico dirigido a mejorar los efectos locales de los genes suicidas en pacientes veterinarios oncológicos, exploramos las respuestas de diferentes líneas celulares de melanoma espontáneo canino a la proteína de fusión de la levadura Saccharomyces cereviseae citosina desaminasa/uracil fosforribosil transferasa (Ycd::Yuprt) en combinación con 5-fluorocitosina (5-FC), mediante transferencia génica no viral. Ycd cataliza el paso 5-FC a 5-fluorouracilo (5-FU) que interfiere con la replicación del ADN, mientras que Yuprt conduce a la síntesis de 5-FUTP que inhibe el procesamiento de ARNr y ARNm. En el presente estudio, encontramos que tanto cultivos en 2D como 3D resultaron sensibles al tratamiento, incluso en aquellas líneas que previamente habían manifestado cierta resistencia a otros genes suicidas ya aplicados en la clínica veterinaria. Exploramos los mecanismos subyacentes a la acción de Ycd::Yuprt/5-FC relacionados con muerte celular, arresto del ciclo celular, estrés oxidativo, capacidad clonogénica y efecto bystander, entre otros. Encontramos muerte celular inducida tanto por apoptosis como necrosis, un gran aumento de la fracción subGo y de células en un estadio de senescencia e inhibición de la formación de colonias frente a una alta concentración de 5-FC. Además, demostramos que la citotoxicidad producida dentro de las células fue capaz de difundirse al entorno extracelular, afectando también a las células que no estuvieron expuestas a la transferencia génica, poniendo en evidencia a un fuerte efecto bystander. Estos resultados fundamentan sólidamente el potencial clínico del sistema suicida Ycd::Yuprt/5-FC como adyuvante de cirugía en pacientes veterinarios oncológicos.
Regardless of its origin, melanoma shares biological similarities in all species. Canine spontaneous melanoma is a highly malignant, metastatic and lethal tumor characterized by rapid growth, local invasion and early metastasis. As a pre-clinical study aimed to improve the local effects of suicide genes on oncologic veterinary patients, we explored the responses of different spontaneous canine melanoma cell lines to yeast Saccharomyces cereviseae cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase fusion protein (Ycd::Yuprt) non-viral gene transfer in combination with 5-fluorocytosine (5-FC). Ycd catalizes the passage of 5-FC to 5-fluorouracil (5-FU) that interferes with DNA replication, while Yuprt drives to the synthesis of 5-FUTP that inhibits rRNA and mRNA processing. In the present study, we found that 2D and 3D cultures were sensitive to this treatment, even in cell lines that had previously shown some resistance to other suicide genes already applied in the veterinary clinic. We explored the underlying mechanisms of Ycd::Yuprt/5-FC related to cell death, cell cycle arrest, oxidative stress, colony formation, and bystander effect, among others. This treatment drove cells to death through apoptosis and necrosis. Furthermore, strongly increased the subGo fraction and the proportion of senescent cells while completely inhibiting colony formation at high concentrations of 5-FC. In addition, we demonstrated that the cytotoxicity produced inside the cells was able to diffuse to the extracellular environment also affecting the cells that were not exposed to gene transfer, evidencing a strong bystander effect. These results strongly support the clinical potential of Ycd::Yuprt/5-FC suicide system as surgery adjuvant treatment in oncologic veterinary patients.
Fil: Allende, Jesica Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.