Zonda, un nuevo regulador de la respuesta autofágica en Drosophila melanogaster

• Autores: Valko, Ayelén
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Wappner, Pablo; Melani, Mariana
• Materia: AUTOFAGIA; AYUNO; HIPOXIA; INMUNOFILINA; ZONDA; OMEGASOMA; AUTOFAGOSOMA; DROSOPHILA; AUTOPHAGY; STARVATION; HYPOXIA; INMUNOPHILIN; ZONDA; OMEGASOME; AUTOPHAGOSOME; DROSOPHILA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La autofagia es un proceso evolutivamente conservado por el que las células eucariotas llevan a cabo la auto-digestión de componentes citoplasmáticos. Este es un mecanismo de adaptación a distintas condiciones de estrés, tales como el ayuno y las infecciones por patógenos intracelulares. En células de mamífero en cultivo, plantas y gusanos se ha visto previamente que la autofagia también puede desencadenarse en respuesta a hipoxia, desempeñando un papel adaptativo esencial en esta condición. Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral estudiamos la autofagia inducida por ayuno o hipoxia, utilizando a Drosophila melanogaster como organismo modelo. La vía autofágica disparada por ayuno se encuentra ampliamente estudiada en este organismo, el cual además puede sobrevivir durante varios días en niveles de oxígeno extremadamente bajos. En el presente trabajo hemos identificado una nueva inmunofilina de Drosophila, que denominamos Zonda, esencial para la autofagia inducida por ayuno. Encontramos que Zonda se requiere en etapas tempranas de la cascada, puntualmente para la deposición de fosfatidilinositol-3-fosfato en estructuras membranosas asociadas al retículo endoplasmático conocidas como omegasomas, proceso mediado por el complejo Vps34 específico de la autofagia. En condiciones basales, Zonda presenta una distribución citoplasmática y luego del ayuno se dispone en foci asociados al retículo endoplasmático, que co-localizan con marcadores de omegasoma. Encontramos también que la nucleación de Zonda depende del complejo de iniciación (Atg1, Atg13 y Atg17), pero no del complejo de nucleación (Vps34, Vps15, Atg6 o Atg14). Asimismo, observamos que Zonda interactúa físicamente con el dominio quinasa de Atg1, así como también con Atg6 y Vps34. Proponemos entonces que Zonda es un nuevo componente de la cascada autofágica requerido para la biogénesis del omegasoma. Paralelamente durante este proyecto de Tesis caracterizamos la respuesta autofágica inducida por hipoxia en D. melanogaster, proceso que hasta el momento no se había analizado en este organismo. Encontramos que este mecanismo se desencadena en células del cuerpo graso de larvas sometidas a 4% O2. La inducción de esta respuesta se estudió a distintos tiempos de exposición hipóxica, mediante el uso de diferentes reporteros de autofagia. A las 2 horas de hipoxia observamos la formación de estructuras autofágicas incipientes, indicando el inicio del proceso. Luego de 6 horas de hipoxia, detectamos la coexistencia de autofagosomas y autolisosomas y, tras 12 horas de hipoxia, la mayoría de las vesículas autofágicas eran degradativos. Sorprendentemente, encontramos que la autofagia inducida por hipoxia se bloqueaba en animales mutantes para Atg1 o Sima (principal factor de transcripción de los genes involucrados en la adaptación a hipoxia). Por el contrario, la autofagia desencadenada por ayuno no mostró esta dependencia con Sima. Por último, larvas mutantes para Atg1 o Atg3 exhibieron una dramática reducción de la sobreviva al desarrollarse en un ambiente hipóxico, al compararlas con animales salvajes. Estos resultados muestran por primera vez que el estrés hipóxico induce una respuesta autofágica robusta en D. melanogaster, comparable a la inducida por ayuno, siendo éste un mecanismo de adaptación a la hipoxia, dependiente de Sima y Atg1.
Autophagy is an evolutionary conserved process by which eukaryotic cells undergo self-digestion of cytoplasmic components. This is an adaptive mechanism to different stressful conditions, like starvation or infections by intracellular pathogens. In mammalian cultured cells, plants and worms, autophagy can also be triggered in response to low oxygen levels, playing an essential adaptive role under this condition. Along this Thesis, we studied autophagy induced by starvation or hypoxia, using Drosophila melanogaster as model organism. The autophagic pathway triggered by starvation has been widely studied in this organism, which can also survive at extremely low oxygen levels for days. In the present work we identified a novel Drosophila immunophilin, essential for starvation-induced autophagy, which we have named Zonda. We found that Zonda is required at early stages of the process, specifically for starvation-induced Vps34-mediated deposition of phosphatidylinsositol-3-phosphate at endoplasmic reticulum-associated membranes known as omegasomes. Under basal conditions, Zonda displays a cytoplasmic distribution, and soon after starvation, nucleates in foci associated with the endoplasmic reticulum that colocalize with omegasome markers. Notably, we found that Zonda nucleation depends on initiation complex (Atg1, Atg13 and Atg17) but does not require nucleation complex (Vps34, Vps15, Atg6 or Atg14). We also observed that Zonda interacts physically with Atg1 through its kinase domain, as well as with Atg6 and Vps34. Hence, we propose that Zonda is an early component of the autophagy cascade required for omegasome biogenesis. Parallelly, during this Thesis project we have characterized the autophagic response induced by hypoxia in D. melanogaster, process that until now had not been analyzed in this organism. We found that the mechanism was triggered in fat body cells of larvae subjected to 4% O2. The induction of this response was examined at several time points of the hypoxic challenge, using different autophagic reporters. We observed autophagosomes forming as early as 2 hours upon hypoxic stimulation, indicating the triggering of the process. After 6 hours of hypoxia, we detected autophagosomes and autolysosomes co-existing in the cells, and by the 12th hour, the majority of autophagic vesicles seemed to be degradative. Notably, we observed that hypoxia-induced autophagy was blocked in larvae mutants for Atg1 or Sima (main transcription factor of genes involved in the adaptation to hypoxia). On the contrary, starvation-induced autophagy did not depend on Sima. Finally, both Atg1 and Atg3 mutant larvae displayed drastic reductions in their lifespans under hypoxic conditions. Altogether, these results show for the first time that hypoxic stress can induce a bona fide autophagic response in D. melanogaster comparable to the one induced by starvation, being this mechanism an adaptive response to hypoxia dependent on Sima and Atg1.
Fil: Valko, Ayelén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.