Incorporación de L-Leucina en Saccharomyces Cerevisiae : Sistemas transportadores en células enteras y protoplastos

• Autores: Kotliar, Natalio
• Año de publicación: 1986
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ramos, Eugenia H.
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El estudio de la incorporación de L-leucina en levaduras S.cerevisiae, cepas silvestre JB65 y mutante deficiente en el translocador ATP/ADP mitocondrial JB64, permitió establecer que la metabolización de sustratos generadores de energía son capaces de estimular el proceso de incorporación del aminoácido. Asimismo, en células energizadas por preincubación con D-glucosa o etanol, la incorporación de L-leucina es significativamente mayor que en células ayunadas, y resulta inhibida por el protonóforo 2,4-dinitrofenol. En la medida de la entrada del aminoácido a la célula se distinguen dos etapas, una de ligado y otra de translocación a través de la barrera de permeabilidad. El estudio cinético de la translocación señala la existencia de dos sistemas definidos como sistemas S1, de alta afinidad y baja velocidad máxima, y sistema S2, de baja afinidad y alta velocidad máxima. Como respuesta a la energización se produce un incremento en las velocidades máximas, sin verificarse variaciones en las constantes de afinidad. En la etapa de ligado se determinó la existencia de dos poblaciones de sitios de unión que operan en el rango de concentraciones de los sistemas de translocación y se definieron, por extensión, S1 y S2. La energización por preincubación con D-glucosa produce un incremento del número de sitios de unión en el sistema S1 (N1). Por digestión enzimática de la pared celular: se obtuvieron protoplastos de levadura de las dos cepas en estudio, verificándose su capacidad para llevar a cabo la incorporación de L-leueina. En protoplastos se estableció la existencia de los dos sistemas de translocación y de ligado definidos en células enteras. La comparación de los parámetros cinéticos calculados en protoplastos, con los calculados en células enteras, sugieren que los componentes esenciales para el ligado y la translocación que determinan los valores de dichos parámetros, se hallan íntimamente asociados a la membrana citoplasmática; no se pierden al llevar a cabo la digestión de la pared celular. Por otro lado, el estudio de los efectos de reactivos de grupos tioles sobre la entrada de L-leucina en células enteras y protoplastos, permitió establecer la participación de distintos grupos sensibles a estos compuestos, distinguiéndose, por su respuesta diferencial, las etapas de ligado y translocación de los dos sistemas. No se detectaron sitios sensibles orientados hacia el medio externo y mediante el empleo de reactivos capaces de penetrar a través de la barrera de permeabilidad se observaron estimulaciones e inhibiciones de la incorporación de L-leucina. En algunos casos, los efectos inhibitorios se relacionaron con un déficit en el aporte energético ya que se verificaron inhibiciones de la respiración celular, concomitantes con la inhibición de la entrada del aminoácido. Finalmente, se evaluó el gradiente de pH de membrana citoplasmática mediante el estudio de distribución intraextracelular de ácido benzoico. Se puso en evidencia que por consumo de sustratos generadores de energía se produce un incremento del ΔpH, que como parte del ΔμH+, constituye la fuerza impulsora del transporte. Esto permite interpretar, en términos de la hipótesis quimiosmótica, la estimulación observada sobre la entrada de L-leucina por el etanol y la D-glucosa y el efecto inhibitorio del 2,4-dinitrofenol, reactivo que produjo un colapso de dicho gradiente.
Fil: Kotliar, Natalio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.