Aislamiento, purificación y caracterización de la nucleósido difosfato quinasa del hongo patógeno Candida albicans : Comparación con otras especies

• Autores: Biondi, Ricardo M.
• Año de publicación: 1996
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Di Bernardo de Passeron, María Susana
• Materia: NUCLEOSIDO DIFOSFATO QUINASA; CANDIDA ALBICANS; FOSFORILACION EN SERINA; FOSFORILACION EN HISTIDINA; SUSTRATO DE CK2; AUTOFOSFORILACION; NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE; CANDIDA ALBICANS; SERINE PHOSPHORYLATION; HISTIDINE PHOSPHORYLATION; CK2 SUBSTRATE; AUTOPHOSPHORYLATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La enzima nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa) es ubicua y cataliza la síntesis de NTPs a partir de sus correspondientes NDPs y un NTP dador (fisiológicamente el ATP). La reacción sigue una cinética de ping-pong con la formación del intermediario de alta energía (P)NDP quinasa. Aparte de su rol fundamental en la síntesis de NTPs, se ha relacionado a esta enzima con a) la activación de proteínas G en la transducción de señales, b) la diferenciación de Drosophila y distintas líneas celulares, c) inhibición de metástasis (nm23), y recientemente ha sido identificada como d) un factor de transcripción. En el presente trabajo se presentan resultados de la purificación y caracterización de la NDP quinasa de Candida albicans, un hongo patógeno oportunista de vertebrados. Se caracterizó la enzima bioquímicamente, en cuanto a su tamaño, al número de subunidades, su punto isoeléctrico, su estabilidad térmica, y la posibilidad de usar distintos NTPs y NDPs como dadores y aceptores de la reacción. A través de dos enfoques experimentales diferentes se demostró que los nucleótidos de guanina y adenina son los mejores aceptores de la reacción (Arch). Biochem. Biophys. (1995), 187-194). Se evaluó a su vez, la capacidad de NDP quinasas de distinto origen de fosforilar a análogos de nucleótidos utilizados en terapias antivirales; para ello, se desarrolló la metodología para medir la actividad NDP quinasa con estos sustratos (J. Biol. Chem. (1996), 271, en prensa). Se estudió la actividad y la presencia de la enzima durante el crecimiento y la morfogénesis del hongo; la actividad específica máxima se encontró durante el crecimiento logarítmico (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Se realizó un estudio detallado del proceso de autofosforilación de la NDP quinasa, y se encontró que sólo se encuentra autofosforilada en residuos de histidina. La autofosforilación de la enzima también se realizó en extractos crudos de C. albicans y de Escherichia coli. Dado que la NDP quinasa se autofosforila en residuos de histidina como parte de su mecanismo de acción, los ensayos para estudiar la posible regulación de la enzima por fosforilación a través de alguna quinasa necesitan de una metodología que pueda distinguir la fosforilación en histidina de aquella en serina o treonina. Se desarrolló entonces una metodología sobre membranas de Immobilon con el uso de buffers de pH 1 y 14 con el agregado de 5 por ciento metano. Esta metodología se utilizó para estudiar la fosforilación in vivo en C. albicans y en células HeLa en cultivo. Se discuten las posibles implicancias de la fosforilación en serina in vivo.
Nucleoside diphosphate kinase (NDP kinase) is a ubiquitous enzyme catalysing the synthesis of NTPs from its corresponding NDPs using a NTP donor (physiologically ATP). The reaction follows a ping-pong mechanism of catalysis with a (P)NDP kinase high energy intermediate. Apart of its essential role in the synthesis of NTPs, this enzyme has been related to a) G-protein interaction in signal transduction, b) differentiation in Drosophila and different cell lines, c) inhibition of metastasis (nm23), and has recently been identified to d) a transcription factor. In the present work, data are presented on the purification of Candida albicans NDP kianse as well as a biochemical characterization of the enzyme, number and type of subunits, pI, thermal stability and the possibility to use as substrates different NTPs and NDPs. By two different approaches, guanine and adenine di and triphosphates were found to be the better acceptors and donors of the reaction (Arch. Biochem. Biophys. (1995), 187-194). The ability of NDP kinase to phosphorylate different anti-HIV nucleotide analogs was addressed, and a methodology was developed to measure the enzyme activity with these substrates (J. Biol. Chem. (1996), 271, in press). The specific activity of the enzyme during the growth and morphogenesis of C. albicans was studied; the specific activity was found to be maximal during logarithmic growth (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Using purified enzyme, a detailed study of the pure enzyme autophosphorylation was carried out; the results indicated that only histidine autophosphorylation was found. Autophosphorylation in C. albicans and Escherichia coli crude extracts was also performed. As NDP kinase autophosphorylates in a histidine residue as part of its kinetic mechanism of action, the studies of phosphorylation by other kinases need to discriminate between phosphorylation on serine/threonine and histidine residues. A method on Immobilon membranes using 5 per centum methanol in buffers of pH 1 and 14 is described. This method was used to study the in vivo phosphorylation of the enzyme in C. albicans and in HeLa cells in culture. Possible implications of in vivo NDP kinase serine phosphorylation are discussed.
Fil: Biondi, Ricardo M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.