Modulación de los parámetros de transferencia electrónica en metaloproteínas de cobre naturales y artificiales

• Autores: Szuster, Jonathan
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Murgida, Daniel Horacio
• Materia: TRANSFERENCIA ELECTRONICA; CITOCROMO C OXIDASA; SITIO DE CuA; SITIO T1; INGENIERIA DE BUCLES; PROTEINAS QUIMERAS; BIOELECTROQUIMICA; ESPECTROSCOPIA; ENERGIA DE REORGANIZACION; POTENCIAL DE REDUCCION; ESTADOS FUNDAMENTALES ALTERNATIVOS; FILMS PROTEICOS; REGIMEN FRICCIONAL; VISCOSIDAD; ELECTRON TRANSFER; CYTOCHROME C OXIDASE; CuA SITE; T1 COPPER SITE; T2 COPPER SITE; LOOP ENGINEERING; CHIMERIC PROTEINS; BIOELECTROCHEMISTRY; SPECTROSCOPY; REORGANIZATION ENERGY; REDUCTION POTENTIAL; ALTERNATIVE GROUND STATES; PROTEIN FILMS; FRICTION-CONTROLLED ET REGIME; VISCOSITY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Este trabajo de tesis trata sobre la relación entre los distintos determinantes estructurales y los parámetros asociados a la reacción de transferencia electrónica (TE) en metaloproteínas de cobre. Se abordaron principalmente dos clases de centros de cobre, centros mononucleares de “tipo 1” (T1) y centros binucleares de tipo CuA. En esta oportunidad el sistema de estudio consiste en el dominio soluble que contiene al sitio de CuA en la citocromo c oxidasa de Thermus thermophilus. Mediante ingeniería de bucles uno de los tres bucles que conforman el sitio binuclear de CuA fue reemplazado por bucles análogos que contienen ligandos que conforman sitios de tipo 1, generando sitios mononucleares de cobre novedosos. También se generaron proteínas quimeras donde esos tres bucles fueron reemplazados total o parcialmente por bucles análogos en de especies eucariotas generando sitios de CuA perturbados. El estudio sobre la colección de quimeras con sitios de T1 en el marco de la teoría de TE de Marcus reveló que el potencial de reducción parece estar determinado esencialmente por la matriz proteica, presentando correlaciones suaves con las distorsiones geométricas introducidas en el sitio de cobre. Por otro lado, la energía de reorganización () está determinada localmente por el grado de exposición a solvente del sitio de cobre, el que depende estrictamente del largo del bucle implantado. Este desacople permite la modulación independiente de ambos parámetros por primera vez en este tipo de sistemas. Por otro lado, la estructura electrónica de los sitios de CuA puede ser descripta mediante una superficie de energía potencial con dos mínimos que se corresponden a dos estados funcionales alternativos. Las quimeras de CuA estudiadas en esta tesis permitieron profundizar nuestro entendimiento sobre las propiedades estructurales que determinan la interconversión entre ambos estados, la cual se cree que cumple un rol fundamental en la TE in vivo. Finalmente, se abordó el estudio de los mecanismos de TE heterogénea bajo el régimen de control friccional, donde empleando soluciones con distinto grado de viscosidad se interrogó el rol de la dinámica proteica. Empleando films proteicos adsorbidos sobre electrodos funcionalizados se logró modular sistemáticamente el grado de acoplamiento electrónico del binomio proteína-electrodo, y de esta manera el pasaje gradual desde un régimen no adiabático, donde vale la Teoría de Marcus de TE, a un régimen más complejo que no puede ser explicado por dicha teoría. Los resultados obtenidos permitieron el desarrollo de una nueva propuesta de TE para este régimen.
This dissertation discusses on the relation between different structural determinants and the parameters associated with the electron transfer (ET) in copper metalloproteins. Specifically, it addresses two types of copper centres, mononuclear type 1 copper sites (T1) and binuclear CuA sites. In this opportunity the protein moiety consisted in a soluble domain that contains the CuA site in the cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus. Employing a loop swapping strategy one of the loops that define the CuA site was replaced by analogous sequences that carry the coordinating residues that are involved in the assembly of T1 copper sites. This procedure led to a set of different chimeric proteins which harbour novel T1 copper sites. Another set of chimeric proteins was developed by replacing either one or three of the loops that assembly the CuA site by analogous sequences from eukaryotic organisms, leading to a set of chimeras with perturbed CuA sites. The study of the chimeras with T1 copper sites within the framework of Marcus TE theory revealed that the reduction potential is determined by the protein scaffold, showing smooth correlations with geometric distortions introduced in the metal site. Furthermore, the reorganization energy, , is determined by the degree of exposure of the metal site to the surrounding solvent. This exposure, in turn, depends strictly on the length of the loop sequence implanted. The disconnection between these two parameters allow for their independent modulation, for the first time in this type of systems. On the other hand, the electronic structure of the CuA sites can be described as a double-well potential energy surface where both minima correspond to two functional alternative ground states. The CuA chimeras studied in this thesis allow us to deepen our understanding in how the structural properties of the metal centre determine the interconversion between these ground states, which are proposed to play a major role in in vivo ET processes. Finally, the mechanism of heterogeneous ET under a friction-controlled regime was studied. By changing the viscosity of the protein surroundings we tested the role of the protein dynamics in the ET process. Employing protein films adsorbed on biocompatible coated electrodes we were able to change systematically the degree of electronic coupling between the metal centre and the electrode surface. This strategy allows us to gradually leave the non-adiabatic regime, were Marcus ET theory is valid, an enter to a more complex and non-trivial regime which cannot be treated within the Marcus framework. Our results help to develop a new ET theory for this specific regime.
Fil: Szuster, Jonathan. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.