Mecanismos regulatorios y manipulación de las propiedades de transferencia electrónica en metaloproteínas de cobre

• Autores: Zitare, Ulises Alejandro
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Murgida, Daniel Horacio
• Materia: TRANSFERENCIA ELECTRONICA; CITOCROMO C OXIDASA; SITIO DE CUA; SITIO T1; MARCUS; BIOELECTROQUIMICA; ESPECTROSCOPIA; MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS; ESTADOS FUNDAMENTALES ALTERNATIVOS; SWITCH FUNCIONAL; MUTAGENESIS DIRIGIDA; MATRIZ PROTEICA; ELECTRON TRANSFER; CYTOCHROME C OXIDASE; CUA SITE; T1 SITE; MARCUS; BIOELECTROCHEMISTRY; SPECTROSCOPY; SELF-ASSEMBLED MONOLAYERS; ALTERNATIVE GROUND STATES; FUNCTIONAL SWITCH; DIRECTED MUTAGENESIS; PROTEIN BACKBONE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En esta tesis se aborda el estudio de los parámetros que regulan las reacciones detransferencia electrónica (TE) en metaloproteínas que contienen dos tipos de sitios decobre distintos. Para ello se utilizó una variedad de métodos espectroscópicos yelectroquímicos, cuyos resultados fueron analizados en el marco de la teoría de Marcusde TE. El principal modelo de estudio es un fragmento soluble de la citocromo ba3oxidasa de Thermus thermophilus (Tt-CuA), que contiene el centro binuclear de CuA,aceptor de electrones primario de la enzima. Mediante distintas estrategias demutagénesis tales como mutaciones puntuales de primera esfera de coordinación oingeniería de bucles, se investigaron los factores que determinan las propiedadeselectrónicas del sitio nativo, y que en última instancia determinan los mecanismosregulatorios de la TE. Desde la óptica de la termodinámica estadística, se logróracionalizar las contribuciones entálpica y entrópica al potencial de reducción del sitiode CuA y se verificó la aditividad de los efectos producidos por las distintas mutacionesde primera y segunda esfera de coordinación. Diferentes estudios espectroscópicos (RR, RMN, UV-Vis, EPR) revelan que laestructura electrónica del sitio de CuA puede ser descripta mediante una superficie deenergía potencial con dos pozos que corresponden a estados fundamentalesalternativos. Más aún, la población relativa de estos estados puede ser modulada através de mutaciones de primera y segunda esfera, y en una mutante específicamediante el pH del medio. Empleando voltametría cíclica de films proteicos fue posibledeterminar los parámetros cinéticos de TE para ambos estados fundamentales demanera independiente. En particular, la mutante puntual de ligando axial M160Hconstituye el primer caso conocido en que resulta posible activar selectivamente dosestados fundamentales diferentes mediante un simple cambio de pH. Por otra parte, estudios realizados sobre sitios de cobre tipo 1 (T1) reconstruidos enel esqueleto proteico de Tt-CuA mediante ingeniería de bucles muestran clarasdiferencias en relación a los sitios T1 nativos. Grandes cambios espectroscópicos onotables desplazamientos de los potenciales redox demuestran el rol determinante dela matriz proteica sobre las propiedades estructurales y funcionales de los sitios redox. Estos sistemas novedosos presentan además la capacidad de modificar la coordinacióndel sitio activo a partir del agregado de un ligando exógeno sin perder su actividad redox,permitiendo el estudio de este tipo de fenómenos en un sistema biológico.
The purpose of this thesis is to study the parameters that regulate electron transfer (ET) reactions in metalloproteins containing two different kinds of copper sites. A varietyof spectroscopic and electrochemical methods were used in the research and the resultswere analyzed in the context of Marcus ET theory. The main study model is a solublefragment of the cytochrome ba3 oxidase from Thermus thermophiles that contains the CuA binuclear center (Tt-CuA), which is the primary electron acceptor of this enzyme. Using different mutagenesis strategies, such as axial ligand point mutations -in the firstcoordination sphere- or loop engineering, elements defining the native site electronicproperties, which also define ET regulatory mechanisms, were analyzed. The entropicand enthalpic contributions to the reduction potential of the CuA site were rationalizedin terms of statistical thermodynamics, and the additivity of first and secondcoordination sphere mutational effects was verified. Spectroscopic studies (RR, NMR, UV-Vis, EPR) reveal that the electronic structure ofthe CuA site can be described by a double well potential energy surface related toalternative ground states. Moreover, relative populations of these states can bemodulated through mutations in the first and second coordination sphere, and throughpH in a particular point mutant. By means of protein film cyclic voltammetry, ET kineticparameters in both ground states could be independently established. The mutant M160H constitutes the first example of a model center in which two different groundstates can be selectively activated through a simple pH change. Finally, the characterization of type 1 (T1) sites artificially introduced in the Tt-CuAprotein backbone by loop engineering shows prominent differences with respect tonative T1 sites. This includes important spectroscopic changes and large redox potentialshifts; thus pointing out to the decisive role played by the protein matrix in definingfunctional (redox) and structural properties. These novel systems also show thecapability to bind exogenous ligands without losing its redox activity, allowing researchof this kind of phenomenon in a biological system.
Fil: Zitare, Ulises Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.