Importancia de las células mesenquimales estromales CD105 (+)/CD34 (-) en la evolución del cáncer de mama

• Autores: Giorello, María Belén
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Chasseing, Norma Alejandra; Labovsky, Vivian
• Materia: FIBROBLASTOS ASOCIADOS AL CANCER; CD105; CANCER DE MAMA; CELULAS MADRE MESENQUIMALES/ESTROMALES; METASTASIS OSEAS; EVOLUCION TUMORAL
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Actualmente se sabe que la evolución del cáncer de mama no sólo depende de las características de las células tumorales mamarias, sino también de la composición del microambiente tumoral, el cual juega un papel fundamental en el crecimiento del tumor primario y su progresión hacia una futura metástasis. Dentro del microambiente tumoral mamario, la mayoría de las células estromales son fibroblastos, y el 80% de los mismos están activados, denominándose fibroblastos asociados al cáncer (CAFs). Los CAFs son células estromales mesenquimales fusiformes, negativas para CD34, CD31 y citoqueratina, y positivas para α-SMA, FSP, FAP, entre otros marcadores. Sin embargo, las características fenotípicas de los CAFs pueden modificarse dependiendo del subtipo de cáncer de mama. En cuanto a su función, los CAFs dentro del microambiente tumoral mamario secretan varios componentes de la matriz extracelular (MEC) (como colágeno I y ácido hialurónico), factores de crecimiento, citoquinas, proteasas y hormonas, todos ellos componentes que promueven la iniciación, crecimiento, angiogénesis, invasión y metástasis del cáncer de mama. Entre las cuatro poblaciones celulares más importantes que dan origen a los CAFs están: las células madre mesenquimales (MSCs) de médula ósea (MO), los fibroblastos del microambiente estromal mamario (principal fuente), las células tumorales (por su transición epitelio-mesenquimal – EMT) y las células endoteliales (por su transdiferenciación endotelio-mesenquimal). Las células tumorales liberan factores como el factor de crecimiento transformador β (TGF-β), factor derivado de células estromales tipo 1 (SDF-1 o CXCL-12), interleuquina (IL) -6, entre otros, que favorecen el proceso de diferenciación de las células anteriormente mencionadas, en particular las MSCs, a CAFs, y su posterior activación. Se observó que las MSCs de MO pueden migrar al tumor primario de mama en los estadios tempranos de la enfermedad y favorecer el desarrollo tumoral como constituyentes de su microambiente, ya sea como tales o diferenciadas a CAFs. En relación, el 90-95% de las MSCs de MO humana se caracterizan por presentar CD105 (endoglina), y el 50% de los CAFs expresan CD105 en el estroma tumoral de las pacientes con cáncer de mama (PCM). El antígeno CD105 es el co-receptor de TGF-β, siendo el TGF-β el modulador de la respuesta, regulando la proliferación, migración, diferenciación y apoptosis celular. Además, se sabe que CD105 juega un rol importante tanto en el mantenimiento de propiedades stemness como en el homing de las MSCs de MO hacia el tumor primario mamario a través de la señal de TGF-β. Dentro del microambiente tumoral, el TGF-β favorece la diferenciación de las MSCs a CAFs, estimula la proliferación y activación de los CAFs, así como aumenta su actividad antitumoral al inducir la liberación de MEC, entre otros factores. En estudios anteriores encontramos: 1) que las células tumorales presentes en los tumores primarios de PCM (mujeres con carcinoma ductal infiltrante, estadio I y II, libres de tratamiento) producen sustancias quimiotácticas de MSCs de MO como IL-6, SDF-1 y ligando 2 de quimioquina motivo C-C (CCL-2); y existe una asociación significativa entre la expresión de estos ligandos en las células tumorales y la expresión de sus receptores IL-6R, CXCR-4 y CCR-2, respectivamente, presentes en las células estromales intra-tumor de morfología fusiforme, fibroblast-like, no asociada a la vasculatura; 2) expresión de actina de músculo liso α (α-SMA), proteína de específica de fibroblasto (FSP), molécula de adhesión celular del melanoma (CD146) y CD105 en las células estromales fusiformes no asociadas a la vasculatura, CD34(-), de las PCM ductal infiltrante temprano (estadio clínico-patológico I y II, n=56); 3) expresión diferencial de CD105 entre el tejido tumoral mamario y el tejido no neoplásico, siendo dicha expresión nula dentro del tejido no neoplásico; y 4) que la alta expresión de CD105 en estas células estromales es un nuevo marcador para la identificación de PCM temprano (n=56) que presentan alto riesgo de desarrollar metástasis en menor tiempo y menor sobrevida global (OS). Teniendo en cuenta estos últimos antecedentes, en este trabajo de tesis doctoral nos pareció esencial continuar estudiando, en una cohorte más grande de PCM (n=350), si la expresión de CD105 en estas células estromales fusiformes, no asociadas a la vasculatura CD34(-), constituye un biomarcador pronóstico independiente de ocurrencia de metástasis sitio específico, particularmente óseas. Más aún, nos interesó conocer las características fenotípicas, moleculares y funcionales de las células estromales CD105(+)/CD34(-) que puedan explicar, en parte, su origen y rol en la evolución tumoral. En el presente trabajo encontramos que: 1) la expresión de CD105 en células estromales fusiformes CD105(+), no asociadas con la vasculatura CD34(-), se asoció con la edad de la PCM y el tamaño del tumor primario. El 42,22% de las pacientes menores de 50 años presentaban una alta expresión de CD105, mientras que el 28,85% de las pacientes de 50 años o más tenían una alta expresión de CD105. Además, el 43,65% de las PCM con un tamaño de tumor >2 cm presentaban una alta expresión de CD105, mientras que el 25,89% de las PCM con un tamaño de tumor ≤2 cm también tenían una alta expresión de este marcador; 2) la expresión de CD105 se asoció con la ocurrencia de metástasis, particularmente óseas. Además, la expresión de este marcador se asoció con el tamaño del foco metastásico óseo, el número de focos metastásicos óseos, con la presencia de microcalcificaciones anárquicas previas al diagnóstico del cáncer de mama y con el dolor óseo previo a la metástasis ósea. Las PCM que presentaron alta expresión de CD105 en células estromales fusiformes, fibroblast-like, presentaron múltiples focos metastásicos dentro de dicho tejido. Además, estas PCM presentaron microcalcificaciones anárquicas en el estroma mamario previo al diagnóstico del cáncer de mama. Más aún, las PCM con elevada expresión de CD105 experimentaron dolor óseo previo al diagnóstico de las metástasis óseas.; y 3) la expresión de CD105 en las células estromales fusiformes, fibroblast-like, no asociadas a la vasculatura, es un biomarcador pronóstico independiente del tiempo libre de metástasis (MFS), particularmente metástasis óseas (BMFS). Por otro lado, a través del estudio prospectivo encontramos que la subpoblación de células estromales fusiformes CD105(+)/CD34(-), respecto a las células CD105(-)/CD34(-), tenía: 1) mayor expresión de CD146, proteína de adhesión de células vasculares 1 (CD106), receptor α del factor de crecimiento derivado de plaquetas (CD140α o PDGFRα), desmina y subunidad beta de la enzima prolil 4-hidroxilasa (P4Hβ); 2) semejante capacidad de auto-renovación/clonado para dar un número equivalente de unidades formadoras de colonias fibroblásticas (CFU-F)/ 100 células cultivadas, pero las CFU-F de las células estromales fusiformes CD105(+)/CD34(-) presentaron mayor tamaño, es decir, tenían mayor número de células, con un área/célula menor; 3) mayor tasa de proliferación celular, lo cual coincidió con un mayor porcentaje de células en fase de duplicación celular (fase S); 4) mayores niveles de especies oxigendas reactivas (ROS) mitocondriales y totales; 5) mayor expresión génica de MCAM (CD146), factor de transcripción 2 de la Familia RUNX (RUNX2), ligando del receptor del factor nuclear kappa-β (RANKL), VCAM (CD106) y tenascina C (TNC); 6) mayor capacidad para inducir la migración de las células tumorales mamarias humana MCF-7 y mayor capacidad para inducir la proliferación de las células tumorales mamarias humana MDA-MB231; y 7) mayor capacidad para inducir la expresión de genes asociados con la stemness y la diferenciación osteogénica, especialmente aquellos que confieren a las células tumorales características de células madre con propiedades osteoblásticas, en las líneas celulares tumorales MCF-7 y MDA-MB231. Por lo tanto, todos estos resultados nos indican que existen características diferenciales entre ambas subpoblaciones, y es necesario e interesante realizar futuras investigaciones para conocer en mayor profundidad los mecanismos moleculares por los cuales influyen en la evolución del cáncer de mama. Finalmente, de todo lo expuesto, surge que la presencia de CAFs CD105(+)/CD34(-) tiene un impacto significativo en el pronóstico de las PCM. Estos CAFs pueden servir como biomarcadores en el diagnóstico clínico, terapia y pronóstico de este tipo de cáncer. Por lo tanto, estudiarlos nos permitiría identificar de forma oportuna a las pacientes con alto riesgo de desarrollar metástasis óseas, así como definir estrategias diagnósticas y terapéuticas en las etapas más tempranas de la enfermedad.
Currently, it is known that the evolution of breast cancer not only depends on the characteristics of the breast cancer cells but also on the composition of the tumor microenvironment, which plays a fundamental role in the growth of the primary tumor and its progression toward future metastasis. Within the breast tumor microenvironment, most stromal cells are fibroblasts, and 80% of them are activated, being referred to as cancer- associated fibroblasts (CAFs). CAFs are spindle-shaped mesenchymal stromal cells, negative for CD34, CD31, and cytokeratin, and positive for α-SMA, FSP, FAP, among other markers. However, the phenotypic characteristics of CAFs can vary depending on the subtype of breast cancer. Regarding their function, CAFs within the breast tumor microenvironment secrete various extracellular matrix (ECM) components (such as collagen I and hyaluronic acid), growth factors, cytokines, proteases, and hormones, all of which promote the initiation, growth, angiogenesis, invasion, and metastasis of breast cancer. The four main cellular populations that give rise to CAFs are: bone marrow (BM) mesenchymal stem cells (MSCs), fibroblasts from the breast stromal microenvironment (main source), tumor cells (via epithelial-mesenchymal transdifferentiation – EMT), and endothelial cells (via endothelial-mesenchymal transdifferentiation). Tumor cells release factors such as transforming growth factor β (TGF-β), stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), interleukin (IL)- 6, among others, which favor the differentiation process of the aforementioned cells, particularly MSCs, into CAFs, and their subsequent activation. It was observed that BM MSCs can migrate to the primary breast tumor in the early stages of the disease and promote tumor development as constituents of its microenvironment, either as such or differentiated into CAFs. In relation, 90-95% of human BM-MSCs are characterized by presenting CD105 (endoglin), and 50% of CAFs express CD105 in the tumor stroma of patients with breast cancer (BCP). The CD105 antigen is the co-receptor of TGF-β, with TGF- β being the response modulator, regulating cell proliferation, migration, differentiation, and apoptosis. Additionally, it is known that CD105 plays an important role both in maintaining stemness properties and in the homing of BM-MSCs to the primary breast tumor through the TGF-β signal. Within the tumor microenvironment, TGF-β promotes the differentiation of MSCs into CAFs, stimulates the proliferation and activation of CAFs, and increases their antitumor activity by inducing the release of ECM components, among other factors. In previous studies, we found: 1) that tumor cells present in primary tumors of BCP women with invasive ductal carcinoma, stage I and II, treatment-free) produce chemotactic substances for BM-MSCs such as IL-6, SDF-1, and chemokine motif C-C ligand 2 (CCL-2); and there is a significant association between the expression of these ligands in tumor cells and the expression of their receptors IL-6R, CXCR-4, and CCR-2, respectively, present in spindle- shaped intra-tumor stromal cells (fibroblast-like), not associated with the vasculature; 2) expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), fibroblast-specific protein (FSP), melanoma cell adhesion molecule (CD146), and CD105 in spindle-shaped stromal cells not associated with the vasculature, CD34(-), of early invasive ductal BCP (clinical-pathological stage I and II, n=56); 3) differential expression of CD105 between breast tumor tissue and non- neoplastic tissue, with such expression being null within the non-neoplastic tissue; and 4) that high expression of CD105 in these stromal cells is a new marker for the identification of early BCP (n=56) with a high risk of developing metastasis in a shorter time and lower overall survival. Considering these findings, in the current thesis work, we found it essential to continue studying, in a larger cohort of BCP (n=350), whether the expression of CD105 in these spindle-shaped stromal cells, not associated with the vasculature CD34(-), constitutes an independent prognostic biomarker for the occurrence of site-specific metastasis, particularly bone. Moreover, we were interested in knowing the phenotypic, molecular, and functional characteristics of CD105(+)/CD34(-) stromal cells that might partly explain their origin and role in tumor evolution. In the present work, we found that: 1) the expression of CD105 in spindle-shaped stromal cells, not associated with the vasculature CD34(-), was associated with the age of the BCP and the size of the primary tumor. The 42.22% of patients under 50 years old had high CD105 expression, while 28.85% of patients aged 50 or older had high CD105 expression. Additionally, 43.65% of BCP with a tumor size >2 cm had high CD105 expression, while 25.89% of BCP with a tumor size ≤2 cm also had high expression of this marker; 2) the expression of CD105 was associated with the occurrence of metastasis, particularly bone. Additionally, the expression of this marker was associated with the size of the bone metastatic focus, the number of bone metastatic foci, the presence of anarchic microcalcifications prior to the diagnosis of breast cancer, and bone pain prior to bone metastasis. BCP with high expression of CD105 in spindle-shaped stromal cells, fibroblast- like, had multiple metastatic foci within said tissue. Additionally, these BCP had anarchic microcalcifications in the breast stroma prior to the diagnosis of breast cancer. Furthermore, BCP with high CD105 expression experienced bone pain prior to the diagnosis of bone metastases; and 3) the expression of CD105 in spindle-shaped stromal cells, fibroblast-like, not associated with the vasculature, is an independent prognostic biomarker for metastasis-free time, particularly bone metastasis. On the other hand, through the prospective study, we found that the subpopulation of CD105(+)/CD34(-) spindle-shaped stromal cells, compared to CD105(-)/CD34(-) cells, had: 1) higher expression of CD146, vascular cell adhesion protein 1 (CD106), platelet derived growth factor receptor alpha (CD140α or PDGFRα), desmin, and the beta subunit of prolyl 4-hydroxylase enzyme (P4Hβ); 2) similar self-renewal/cloning capacity to give an equivalent number of fibroblastic colony-forming units (CFU-F)/ 100 cultured cells, but the CFU-F of CD105(+)/CD34(-) spindle-shaped stromal cells were larger, i.e., had a greater number of cells, with a smaller area/cell as well; 3) higher cell proliferation rate, which coincided with a higher percentage of cells in the cell duplication phase (S phase); 4) higher levels of mitochondrial and total ROS; 5) higher gene expression of MCAM (CD146), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), receptor activator of nuclear factor kappa-β ligand (RANKL), VCAM (CD106), and tenascin C (TNC); 6) greater ability to induce the migration of MCF-7 human breast cancer cells and greater ability to induce the proliferation of MDA-MB231 human breast cancer cells; 7) greater ability to induce the expression of genes associated with stemness and osteogenic differentiation, especially those that confer tumor cells characteristics of stem cells with osteoblastic properties, in the MCF-7 and MDA-MB231 tumor cell lines. Therefore, all these results indicate that there are differential characteristics between both subpopulations, and it is necessary and interesting to conduct future research to gain a deeper understanding of the molecular mechanisms by which they influence the evolution of breast cancer. Finally, from all the above, it emerges that the presence of CD105(+)/CD34(-) CAFs has a significant impact on the prognosis of BCP. These CAFs can serve as biomarkers in the clinical diagnosis, therapy, and prognosis of this type of cancer. Therefore, studying them would allow us to timely identify patients at high risk of developing bone metastases, as well as define diagnostic and therapeutic strategies in the early stages of the disease.
Fil: Giorello, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.