Estudio del rol del transporte axonal en la via nigroestriatal en ratones knockout condicionales del motor molecular kif5b

• Autores: Cromberg, Lucas Eneas
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Falzone, Tomás Luis
• Materia: KIF5B; VIA NIGROESTRIATAL; RECEPTORES DOPAMINERGICOS; DOPAMINA; LOCOMOCION; KIF5B; NIGROSTRIATAL PATHWAY; DOPAMINE RECEPTORS; DOPAMINE; LOCOMOTION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los ganglios basales son una cadena de núcleos subcorticales que facilitan lacoordinación motora. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra parscompacta modulan la actividad de de las neuronas GABAérgicas del estriado queson inervadas por la corteza motora. En el estriado conviven dos tipos de neuronas GABAérgicas. Las de la vía directa, que expresan los receptores dopaminérgicos D1 estimulando los movimientos y las de la vía indirecta, que expresan losreceptores dopaminérgicos del tipo D2, cuya función es inhibir los movimientos. Para la iniciación de los movimientos se requiere la activación conjunta de ambasvías. La enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativamás común. Se caracteriza por la muerte progresiva de las neuronasdopaminérgicas, la cual genera fallas en la coordinación motora, defectos en lapostura y problemas para el inicio de los movimientos. La enfermedad de parkinsonestá caracterizada patológicamente por el agregado intracelular de los cuerpos de Lewy (formados por α-synucleína) y los ovillos neurofibrilares (formados por laproteína tau en estado hiperfosforilado). Estas marcas de patología sugieren quedefectos en el sistema de transporte axonal podrían estar involucrados en laenfermedad. Las neuronas dopaminérgicas son células con una alta polarizaciónque les permite conectar con neuronas localizadas a grandes distancias. Estapolarización las hace depender de un complejo sistema de transporte compuestopor microtúbulos, motores moleculares y cargas. Kinesina-1 es un motor molecularanterógrado que lleva las cargas hacia el cono axonal. Es un heterotetrámero dedos subunidades pesadas (KHC) que interactúan con los microtúbulos y dossubunidades livianas (KLC) que interactúan con las cargas directamente o a travésde proteínas adaptadoras. Existen tres genes que codifican para KHC, kif5a y kif5cque se expresan en el sistema nervioso y kif5b de expresión ubicua. Trabajosprevios demostraron que ratones con defectos en la expresión del motor molecular KLC1 desarrollan patologías axonales con agregados de proteínas. Por otro lado, ladeleción de kif5b resulta letal y los ratones knockout mueren en el día embrionario 11.5 sin embargo su rol específico en el sistema nervioso no está esclarecido. El objetivo de este trabajo es estudiar el rol específico de la subunidad Kif5b delmotor molecular Kinesina-1 en la vía nigroestriatal. Se generaron ratones condeleción de la expresión del motor molecular kif5b de forma condicional enneuronas del sistema nervioso central, usando el sistema cre-loxp dirigido medianteel promotor de nestina (5b fl/fl nes cre/+) para cumplir este objetivo. Experimentos deanálisis del movimiento en el campo abierto y en el rotarod determinaron que losratones 5b fl/fl nes cre/+ presentan fallas en su actividad exploratoria y defectos en lacoordinación motora. Por su parte, los niveles de dopamina no se habían vistoafectados, sin embargo hubo una disminución en los niveles de degradación dedopamina, evidenciándose en una menor concentración del producto dedegradación dopac. Estos resultados sugirieron un rol importante del motor kif5b enla vía nigroestriatal y en el metabolismo de dopamina. Para testear si los defectos en el metabolismo de dopamina eran la causa de losdefectos en la locomoción se realizó una deleción condicional de kif5b específicamente en neuronas dopaminérgicas. Sorprendentemente, la deleción de Kif5b específica no indujo alteraciones en la respuesta locomotora sugiriendo quelos defectos presinápticos no son suficientes para evidenciar defectos decoordinación o hipolocomoción. Para comprender si fallas en la locomoción sedebían a problemas en la liberación de dopamina, esta se estimuló mediante lainyección de los ratones 5b fl/fl nes cre/+ con anfetamina. La estimulación conanfetamina, indujo un incremento en la distancia recorrida en ambos genotipos,permitiendo a los ratones 5b fl/fl nes cre/+ alcanzarla distancia obtenida por los ratonescontrol estimulados. Para determinar si la actividad de las vías directa e indirectasdel estriado se encontraban afectadas por la deleción de kif5b se analizó lamotricidad de los ratones en el campo abierto, utilizando agonistas y antagonistasde los receptores D1 y D2. El antagonista de los receptores D1 (SCH 23390) y elagonista de los receptores D2 (quinpirole) disminuyeron la distancia recorrida en losratones 5b fl/fl nes cre/+ y control. Sin embargo, bajo la estimulación con anfetamina,los ratones 5b fl/fl nes cre/+ resultaron insensibles al tratamiento con quinpirole o con unantagonista de los receptores D2 (risperidona), mientras que si se observó unarespuesta en los animales control. Los resultados obtenidos en este trabajosugieren que la expresión de kif5b es necesaria para el correcto recambio dedopamina y para la presentación de los receptores D2 en la membrana plasmáticade las neuronas estriatales permitiendo el correcto desarrollo de la capacidadmotora. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, sugerimos que kif5b tiene un rolespecífico en el metabolismo de dopamina a la vez que su expresión es necesariapara la actividad de los receptores dopaminérgicos del tipo D2. Kif5b esimprescindible para el correcto funcionamiento de la vía nigroestriatal y lalocomoción.
The basal ganglia are a group of subcortical nuclei responsible of the motorcoordination. Dopaminergic neurons from the sustancia nigra pars compacta modulatethe activity of the GABAergic neurons from the striatum which are innervated by corticalneurons. In the striatum coexist two types of GABAergic neurons. Neurons from thedirect pathway express dopamine receptors D1 like and stimulate movement, while GABAergic neurons from the indirect pathway express dopamine receptors D2 like andinhibit movement. Activation of both pathways is required for movement initiation. Parkinson’s disease is the second most common neurodegenerative disorder. It ischaracterized by the dopaminergic cell neurodegeneration which induce motor coordination failures, postural instability, and impairments in the initiation of movements. Parkinson’s disease pathological hallmarks include intracellular accumulation of Lewy Bodies (composed of α-synuclein) and neurofibrillary tangles (composed ofhyperphosphorilated tau). These hallmarks suggest that impairments in the axonaltransport system could be related to the disease. Dopaminergic neurons are highlypolarized cells. Such polarization allows them to connect with other cells localized faraway from the soma. However this morphology depends on a complex transport systemcomposed by microtubule tracks, molecular motors and cargoes. Kinesin-1 is amolecular motor which carries cargoes toward the axonal growth cone. Kinesin-1 is anheterotretamere composed by two heavy subunits (KHC) which interact with themicrotubules and two light subunits (KLC) which interact with the cargoes directly orthrough adaptor proteins. There are three genes coding for KHC, kif5a and kif5cexpressed in the nervous system and the ubiquitously expressed kif5b. Previouspublications have demonstrated that deletion of the KLC1 molecular motor in mice helpthe development of axonal pathologies with protein accumulation. Kif5b deletion is lethaland knockout mice die in the embrionary day 11.5. However the specific role of kif5b inthe nervous system remains unknown. The objective of this work is to study the role of the kif5b subunit of the molecular motor Kinesin-1 in the central nervous system. Conditional transgenic mice with deficits inkif5b expression in neurons were generated with the cre-loxp system directed under thenestin promoter (5b fl/fl nes cre/+) to fulfill this objective. Movement analysis in the openfield and rotarod assays determined that 5b fl/fl nes cre/+ have defects in the spontaneousexploratory activity and in motor coordination. Dopamine levels did not change, howevera decrease in the concentration of the dopamine degradation product, dopac wasobserved, indicating a lower degradation rate of the internalized dopamine. Theseresults suggested an important role of the molecular motor kif5b in the nigrostriatalpathway activity and dopamine metabolism. To analyze if dopamine metabolism impairments were the cause of the locomotiondefects, we deleted kif5b from presynaptic dopaminergic neurons. Surprisingly, thespecific deletion of kif5b did not induced alterations in the motor response suggestingthat presynaptic defects are not sufficient to evidenciate coordination impairment orhipolocomotion. In order to understand if dopamine releasing was impaired, mice wereinjected with amphetamine to stimulate it. Amphetamine stimulation increased runlength by both mice and remarkably 5b fl/fl nes cre/+ mice achieved the same distance runby stimulated control. To determine if the activity of the direct and indirect pathway wereimpaired, 5b fl/fl nes cre/+ mice were the antagonist of the dopamine receptor D1 (SCH 23390) and the agonist of the dopamine receptor D2 (quinpirole) decreased run lengthin both genotypes. However under amphetamine stimulation 5 fl/fl nes cre/+ mice were notsensitive to quinpirole or to the D2 antagonist (risperidone) treatment, while control miceresponded to both drugs. All together the results obtained in this work, we suggest thatkif5b has a specific role in the dopamine metabolism and its expression is necessary forthe D2 receptors activity. Kif5b is fundamental for the proper function of the nigrostriatalpathway and locomotion.
Fil: Cromberg, Lucas Eneas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.