Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano

Autores
Abdian, Patricia
Año de publicación
2005
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis
Ielpi, Luis
Descripción
Trabajos anteriores mostraron que el gen aceA está involucrado en la biosíntesis del exopolisacárido acetano producido por Acetobacter xylinum. El producto de aceA cataliza la tercer etapa en la síntesis de la unidad repetitiva heptasacarídica del acetano. En esta tesis se informa sobre la producción heteróloga y la caracterización de AceA. El producto del gen aceA fue sobreexpresado en Escherichia coli y su función fue caracterizada utilizando un ensayo de actividad desarrollado para la enzima. Se encontró que AceA se localiza en la membrana bacteriana y que la unión a la misma es determinada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La enzima fue solubilizada y purificada a homogeneidad en presencia de detergente. Se determinaron parámetros cinéticos preliminares de la enzima purificada para lo cual fue necesario sintetizar un análogo del sustrato aceptor. AceA es una enzima que actúa con retención de la configuración, y pertenece a la familia 4 de la clasificación CAZY para la cual, al momento de escribir esta tesis, no hay información mecanística ni estructural. Identificamos una serie de residuos conservados sobre los que se realizó mutagénesis sitio-dirigida. El análisis, con un ensayo de actividad in vitro y un ensayo in vivo por complementación heteróloga, nos permitió clasificarlos en cuatro grupos según el fenotipo de las mutantes. Dos glutamatos (E287, E295) y un residuo de lisina (K211) formarían parte del sitio activo de AceA. La importancia de los residuos ácidos fue evaluada por modificación química. Este análisis mostró que al menos un residuo ácido es esencial para la actividad de AceA. A partir de los resultados de mutagénesis, proponemos que este residuo es E287. Finalmente, realizamos el modelado por homología de la estructura 3D de AceA. La superposición de residuos del sitio activo de AceA con los de la glucógeno sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la trealosa-6-P-sintasa de E. coli, reveló un alto grado de similitud y permitió validar los resultados experimentales. El modelo estructural de AceA, también ha sido de ayuda en la localización de otros aminoácidos importantes del sitio activo, en la identificación del probable sitio de unión del aceptor, y en el modo de operar de AceA en la superficie de la membrana.
In earlier work it was shown that the aceA gene is involved in the biosynthesis of the exopolysaccharide acetan, produced by Acetobacter xylinum. The aceA gene product catalyzes the third step in the synthesis of the heptasaccharide repeating unit of acetan. The heterologous production and characterisation of AceA is reported in this thesis. The aceA gene product was overproduced in Escherichia coli and its function was characterised using an activity assay developed for the enzyme. It was found that AceA is located in the bacterial membrane and that hydrophobic and electrostatic interactions are implicated in membrane attachment. The enzyme was solubilized and purified to homogeneity in the presence of detergent. Preliminar kinetic parameters were determined for the purified enzyme, for which it was necessary to synthesise an acceptor analogue. AceA is a retaining CAZY family 4 glycosyltransferase, for which there is no mechanistic or structural information at the time of writing. We identified a series of conserved aminoacids and performed site directed mutagenesis on them. The analysis, by both an in vitro activity assay and an in vivo rescue assay, permitted us to classify them into four groups on the basis of the mutant phenotypes. Two glutamate residues (E287, E295) and a lysine (K211) were proposed to form part of the active site. The importance of acidic residues was assessed by chemical modification. This analysis indicated that at least one acidic residue is essential for AceA activity. From the mutagenesis results, we propose that this residue is E287. Finally, we have performed homology modelling of the 3D structure of AceA. The superposition of the active site residues of AceA with those of glycogen synthase from Agrobacterium tumefaciens and trehalose-6-P-synthase from E. coli, revealed striking similarities and allowed validation of experimental data. The structural model of AceA has also been helpful to locate other important aminoacids in the active site, the probable binding site of the acceptor substrate and the function of AceA at the membrane surface.
Fil: Abdian, Patricia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Materia
GLICOSILTRANSFERASA
ALFA-MANOSILTRANSFERASA
EXOPOLISACARIDO
MUTAGENESIS SITIODIRIGIDA
MODIFICACION QUIMICA
MODELADO MOLECULAR
ACETOBACTER XYLINUM
POLIPRENOL
CAZY
GLYCOSYLTRANSFERASE
ALFA-MANNOSYLTRANSFERASE
EXOPOLYSACCHARIDE
SIDE-DIRECTED MUTAGENESIS
CHEMICAL MODIFICATION
MOLECULAR MODELING
ACETOBACTER XYLINUM
POLYPRENOL
CAZY
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
Repositorio
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institución
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
OAI Identificador
tesis:tesis_n3869_Abdian

id BDUBAFCEN_12c5b6bab78afe2c1ad50cf7c2bd454c
oai_identifier_str tesis:tesis_n3869_Abdian
network_acronym_str BDUBAFCEN
repository_id_str 1896
network_name_str Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
spelling Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetanoAbdian, PatriciaGLICOSILTRANSFERASAALFA-MANOSILTRANSFERASAEXOPOLISACARIDOMUTAGENESIS SITIODIRIGIDAMODIFICACION QUIMICAMODELADO MOLECULARACETOBACTER XYLINUMPOLIPRENOLCAZYGLYCOSYLTRANSFERASEALFA-MANNOSYLTRANSFERASEEXOPOLYSACCHARIDESIDE-DIRECTED MUTAGENESISCHEMICAL MODIFICATIONMOLECULAR MODELINGACETOBACTER XYLINUMPOLYPRENOLCAZYTrabajos anteriores mostraron que el gen aceA está involucrado en la biosíntesis del exopolisacárido acetano producido por Acetobacter xylinum. El producto de aceA cataliza la tercer etapa en la síntesis de la unidad repetitiva heptasacarídica del acetano. En esta tesis se informa sobre la producción heteróloga y la caracterización de AceA. El producto del gen aceA fue sobreexpresado en Escherichia coli y su función fue caracterizada utilizando un ensayo de actividad desarrollado para la enzima. Se encontró que AceA se localiza en la membrana bacteriana y que la unión a la misma es determinada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La enzima fue solubilizada y purificada a homogeneidad en presencia de detergente. Se determinaron parámetros cinéticos preliminares de la enzima purificada para lo cual fue necesario sintetizar un análogo del sustrato aceptor. AceA es una enzima que actúa con retención de la configuración, y pertenece a la familia 4 de la clasificación CAZY para la cual, al momento de escribir esta tesis, no hay información mecanística ni estructural. Identificamos una serie de residuos conservados sobre los que se realizó mutagénesis sitio-dirigida. El análisis, con un ensayo de actividad in vitro y un ensayo in vivo por complementación heteróloga, nos permitió clasificarlos en cuatro grupos según el fenotipo de las mutantes. Dos glutamatos (E287, E295) y un residuo de lisina (K211) formarían parte del sitio activo de AceA. La importancia de los residuos ácidos fue evaluada por modificación química. Este análisis mostró que al menos un residuo ácido es esencial para la actividad de AceA. A partir de los resultados de mutagénesis, proponemos que este residuo es E287. Finalmente, realizamos el modelado por homología de la estructura 3D de AceA. La superposición de residuos del sitio activo de AceA con los de la glucógeno sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la trealosa-6-P-sintasa de E. coli, reveló un alto grado de similitud y permitió validar los resultados experimentales. El modelo estructural de AceA, también ha sido de ayuda en la localización de otros aminoácidos importantes del sitio activo, en la identificación del probable sitio de unión del aceptor, y en el modo de operar de AceA en la superficie de la membrana.In earlier work it was shown that the aceA gene is involved in the biosynthesis of the exopolysaccharide acetan, produced by Acetobacter xylinum. The aceA gene product catalyzes the third step in the synthesis of the heptasaccharide repeating unit of acetan. The heterologous production and characterisation of AceA is reported in this thesis. The aceA gene product was overproduced in Escherichia coli and its function was characterised using an activity assay developed for the enzyme. It was found that AceA is located in the bacterial membrane and that hydrophobic and electrostatic interactions are implicated in membrane attachment. The enzyme was solubilized and purified to homogeneity in the presence of detergent. Preliminar kinetic parameters were determined for the purified enzyme, for which it was necessary to synthesise an acceptor analogue. AceA is a retaining CAZY family 4 glycosyltransferase, for which there is no mechanistic or structural information at the time of writing. We identified a series of conserved aminoacids and performed site directed mutagenesis on them. The analysis, by both an in vitro activity assay and an in vivo rescue assay, permitted us to classify them into four groups on the basis of the mutant phenotypes. Two glutamate residues (E287, E295) and a lysine (K211) were proposed to form part of the active site. The importance of acidic residues was assessed by chemical modification. This analysis indicated that at least one acidic residue is essential for AceA activity. From the mutagenesis results, we propose that this residue is E287. Finally, we have performed homology modelling of the 3D structure of AceA. The superposition of the active site residues of AceA with those of glycogen synthase from Agrobacterium tumefaciens and trehalose-6-P-synthase from E. coli, revealed striking similarities and allowed validation of experimental data. The structural model of AceA has also been helpful to locate other important aminoacids in the active site, the probable binding site of the acceptor substrate and the function of AceA at the membrane surface.Fil: Abdian, Patricia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesIelpi, Luis2005info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06info:ar-repo/semantics/tesisDoctoralapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdianspainfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/arreponame:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)instname:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturalesinstacron:UBA-FCEN2025-10-16T09:29:58Ztesis:tesis_n3869_AbdianInstitucionalhttps://digital.bl.fcen.uba.ar/Universidad públicaNo correspondehttps://digital.bl.fcen.uba.ar/cgi-bin/oaiserver.cgiana@bl.fcen.uba.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:18962025-10-16 09:29:59.7Biblioteca Digital (UBA-FCEN) - Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturalesfalse
dc.title.none.fl_str_mv Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
title Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
spellingShingle Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
Abdian, Patricia
GLICOSILTRANSFERASA
ALFA-MANOSILTRANSFERASA
EXOPOLISACARIDO
MUTAGENESIS SITIODIRIGIDA
MODIFICACION QUIMICA
MODELADO MOLECULAR
ACETOBACTER XYLINUM
POLIPRENOL
CAZY
GLYCOSYLTRANSFERASE
ALFA-MANNOSYLTRANSFERASE
EXOPOLYSACCHARIDE
SIDE-DIRECTED MUTAGENESIS
CHEMICAL MODIFICATION
MOLECULAR MODELING
ACETOBACTER XYLINUM
POLYPRENOL
CAZY
title_short Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
title_full Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
title_fullStr Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
title_full_unstemmed Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
title_sort Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano
dc.creator.none.fl_str_mv Abdian, Patricia
author Abdian, Patricia
author_facet Abdian, Patricia
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Ielpi, Luis
dc.subject.none.fl_str_mv GLICOSILTRANSFERASA
ALFA-MANOSILTRANSFERASA
EXOPOLISACARIDO
MUTAGENESIS SITIODIRIGIDA
MODIFICACION QUIMICA
MODELADO MOLECULAR
ACETOBACTER XYLINUM
POLIPRENOL
CAZY
GLYCOSYLTRANSFERASE
ALFA-MANNOSYLTRANSFERASE
EXOPOLYSACCHARIDE
SIDE-DIRECTED MUTAGENESIS
CHEMICAL MODIFICATION
MOLECULAR MODELING
ACETOBACTER XYLINUM
POLYPRENOL
CAZY
topic GLICOSILTRANSFERASA
ALFA-MANOSILTRANSFERASA
EXOPOLISACARIDO
MUTAGENESIS SITIODIRIGIDA
MODIFICACION QUIMICA
MODELADO MOLECULAR
ACETOBACTER XYLINUM
POLIPRENOL
CAZY
GLYCOSYLTRANSFERASE
ALFA-MANNOSYLTRANSFERASE
EXOPOLYSACCHARIDE
SIDE-DIRECTED MUTAGENESIS
CHEMICAL MODIFICATION
MOLECULAR MODELING
ACETOBACTER XYLINUM
POLYPRENOL
CAZY
dc.description.none.fl_txt_mv Trabajos anteriores mostraron que el gen aceA está involucrado en la biosíntesis del exopolisacárido acetano producido por Acetobacter xylinum. El producto de aceA cataliza la tercer etapa en la síntesis de la unidad repetitiva heptasacarídica del acetano. En esta tesis se informa sobre la producción heteróloga y la caracterización de AceA. El producto del gen aceA fue sobreexpresado en Escherichia coli y su función fue caracterizada utilizando un ensayo de actividad desarrollado para la enzima. Se encontró que AceA se localiza en la membrana bacteriana y que la unión a la misma es determinada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La enzima fue solubilizada y purificada a homogeneidad en presencia de detergente. Se determinaron parámetros cinéticos preliminares de la enzima purificada para lo cual fue necesario sintetizar un análogo del sustrato aceptor. AceA es una enzima que actúa con retención de la configuración, y pertenece a la familia 4 de la clasificación CAZY para la cual, al momento de escribir esta tesis, no hay información mecanística ni estructural. Identificamos una serie de residuos conservados sobre los que se realizó mutagénesis sitio-dirigida. El análisis, con un ensayo de actividad in vitro y un ensayo in vivo por complementación heteróloga, nos permitió clasificarlos en cuatro grupos según el fenotipo de las mutantes. Dos glutamatos (E287, E295) y un residuo de lisina (K211) formarían parte del sitio activo de AceA. La importancia de los residuos ácidos fue evaluada por modificación química. Este análisis mostró que al menos un residuo ácido es esencial para la actividad de AceA. A partir de los resultados de mutagénesis, proponemos que este residuo es E287. Finalmente, realizamos el modelado por homología de la estructura 3D de AceA. La superposición de residuos del sitio activo de AceA con los de la glucógeno sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la trealosa-6-P-sintasa de E. coli, reveló un alto grado de similitud y permitió validar los resultados experimentales. El modelo estructural de AceA, también ha sido de ayuda en la localización de otros aminoácidos importantes del sitio activo, en la identificación del probable sitio de unión del aceptor, y en el modo de operar de AceA en la superficie de la membrana.
In earlier work it was shown that the aceA gene is involved in the biosynthesis of the exopolysaccharide acetan, produced by Acetobacter xylinum. The aceA gene product catalyzes the third step in the synthesis of the heptasaccharide repeating unit of acetan. The heterologous production and characterisation of AceA is reported in this thesis. The aceA gene product was overproduced in Escherichia coli and its function was characterised using an activity assay developed for the enzyme. It was found that AceA is located in the bacterial membrane and that hydrophobic and electrostatic interactions are implicated in membrane attachment. The enzyme was solubilized and purified to homogeneity in the presence of detergent. Preliminar kinetic parameters were determined for the purified enzyme, for which it was necessary to synthesise an acceptor analogue. AceA is a retaining CAZY family 4 glycosyltransferase, for which there is no mechanistic or structural information at the time of writing. We identified a series of conserved aminoacids and performed site directed mutagenesis on them. The analysis, by both an in vitro activity assay and an in vivo rescue assay, permitted us to classify them into four groups on the basis of the mutant phenotypes. Two glutamate residues (E287, E295) and a lysine (K211) were proposed to form part of the active site. The importance of acidic residues was assessed by chemical modification. This analysis indicated that at least one acidic residue is essential for AceA activity. From the mutagenesis results, we propose that this residue is E287. Finally, we have performed homology modelling of the 3D structure of AceA. The superposition of the active site residues of AceA with those of glycogen synthase from Agrobacterium tumefaciens and trehalose-6-P-synthase from E. coli, revealed striking similarities and allowed validation of experimental data. The structural model of AceA has also been helpful to locate other important aminoacids in the active site, the probable binding site of the acceptor substrate and the function of AceA at the membrane surface.
Fil: Abdian, Patricia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
description Trabajos anteriores mostraron que el gen aceA está involucrado en la biosíntesis del exopolisacárido acetano producido por Acetobacter xylinum. El producto de aceA cataliza la tercer etapa en la síntesis de la unidad repetitiva heptasacarídica del acetano. En esta tesis se informa sobre la producción heteróloga y la caracterización de AceA. El producto del gen aceA fue sobreexpresado en Escherichia coli y su función fue caracterizada utilizando un ensayo de actividad desarrollado para la enzima. Se encontró que AceA se localiza en la membrana bacteriana y que la unión a la misma es determinada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La enzima fue solubilizada y purificada a homogeneidad en presencia de detergente. Se determinaron parámetros cinéticos preliminares de la enzima purificada para lo cual fue necesario sintetizar un análogo del sustrato aceptor. AceA es una enzima que actúa con retención de la configuración, y pertenece a la familia 4 de la clasificación CAZY para la cual, al momento de escribir esta tesis, no hay información mecanística ni estructural. Identificamos una serie de residuos conservados sobre los que se realizó mutagénesis sitio-dirigida. El análisis, con un ensayo de actividad in vitro y un ensayo in vivo por complementación heteróloga, nos permitió clasificarlos en cuatro grupos según el fenotipo de las mutantes. Dos glutamatos (E287, E295) y un residuo de lisina (K211) formarían parte del sitio activo de AceA. La importancia de los residuos ácidos fue evaluada por modificación química. Este análisis mostró que al menos un residuo ácido es esencial para la actividad de AceA. A partir de los resultados de mutagénesis, proponemos que este residuo es E287. Finalmente, realizamos el modelado por homología de la estructura 3D de AceA. La superposición de residuos del sitio activo de AceA con los de la glucógeno sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la trealosa-6-P-sintasa de E. coli, reveló un alto grado de similitud y permitió validar los resultados experimentales. El modelo estructural de AceA, también ha sido de ayuda en la localización de otros aminoácidos importantes del sitio activo, en la identificación del probable sitio de unión del aceptor, y en el modo de operar de AceA en la superficie de la membrana.
publishDate 2005
dc.date.none.fl_str_mv 2005
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
http://purl.org/coar/resource_type/c_db06
info:ar-repo/semantics/tesisDoctoral
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdian
url https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3869_Abdian
dc.language.none.fl_str_mv spa
language spa
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
eu_rights_str_mv openAccess
rights_invalid_str_mv https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.publisher.none.fl_str_mv Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
publisher.none.fl_str_mv Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
instname:Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
instacron:UBA-FCEN
reponame_str Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
collection Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
instname_str Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
instacron_str UBA-FCEN
institution UBA-FCEN
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital (UBA-FCEN) - Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
repository.mail.fl_str_mv ana@bl.fcen.uba.ar
_version_ 1846142842362134528
score 12.712165