Análisis bioquímico, funcional y estructural de AceA, una alfa-manosiltransferasa involucrada en la biosíntesis del exopolisacárido acetano - Abdian, Patricia (2005)
Trabajos anteriores mostraron que el gen aceA está involucrado en la biosíntesis del exopolisacárido acetano producido por Acetobacter xylinum. El producto de aceA cataliza la tercer etapa en la síntesis de la unidad repetitiva heptasacarídica del acetano. En esta tesis se informa sobre la producción heteróloga y la caracterización de AceA. El producto del gen aceA fue sobreexpresado en Escherichia coli y su función fue caracterizada utilizando un ensayo de actividad desarrollado para la enzima. Se encontró que AceA se localiza en la membrana bacteriana y que la unión a la misma es determinada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. La enzima fue solubilizada y purificada a homogeneidad en presencia de detergente. Se determinaron parámetros cinéticos preliminares de la enzima purificada para lo cual fue necesario sintetizar un análogo del sustrato aceptor. AceA es una enzima que actúa con retención de la configuración, y pertenece a la familia 4 de la clasificación CAZY para la cual, al momento de escribir esta tesis, no hay información mecanística ni estructural. Identificamos una serie de residuos conservados sobre los que se realizó mutagénesis sitio-dirigida. El análisis, con un ensayo de actividad in vitro y un ensayo in vivo por complementación heteróloga, nos permitió clasificarlos en cuatro grupos según el fenotipo de las mutantes. Dos glutamatos (E287, E295) y un residuo de lisina (K211) formarían parte del sitio activo de AceA. La importancia de los residuos ácidos fue evaluada por modificación química. Este análisis mostró que al menos un residuo ácido es esencial para la actividad de AceA. A partir de los resultados de mutagénesis, proponemos que este residuo es E287. Finalmente, realizamos el modelado por homología de la estructura 3D de AceA. La superposición de residuos del sitio activo de AceA con los de la glucógeno sintasa de Agrobacterium tumefaciens y la trealosa-6-P-sintasa de E. coli, reveló un alto grado de similitud y permitió validar los resultados experimentales. El modelo estructural de AceA, también ha sido de ayuda en la localización de otros aminoácidos importantes del sitio activo, en la identificación del probable sitio de unión del aceptor, y en el modo de operar de AceA en la superficie de la membrana.