Identificación, caracterización parcial y purificación de la UDP : GlC: glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata, una nueva reacción de procesamiento de glicoproteínas...

• Autores: Trombetta, Eduardo Sergio
• Año de publicación: 1992
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Parodi, Armando José
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La N-glicosilación de proteínas se inicia en el retículo endoplásmico con la transferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde dolicol-P-Pa polipéptidos nacientes [1]. El oligosacárido unido a la proteína es inmediatamente procesado por glucosidasas específicas en el lumen del reticulo endoplásmico. La glucosidasa I hidroliza el residuo de Glc más externo en unión α(1,2) y luego la glucosidasa II hidroliza los dos residuos de Glc más internos en unión α(1,3). También pueden removerse algunas manosas por acción de manosidasas en el RE. Luego las glicoproteínas son procesadas a lo largo del camino secretorio por una serie de glicosidasas y glicosiltransferasas, con hidrólisis de restos de manosa, transferencia de N-acetilglucosamina, galactosa, ácido siálico y fucosa, lo que da lugar a la variedadde estructuras encontrada en las glicoproteínas maduras. Por marcación con [14C]glucosa en células de mamíferos, plantas, hongos y tripanosomátidosse detectó la formación de [glucosa-14C]-Glc1Man5-9GlcNAc2 unidosa proteínas [2-10]. Los resultados experimentales indicaban que estos compuestos seformaron en parte por glucosilación de los correspondientes Man5-9GlcNAc2-Prot sinintervención de derivados de dolicol. En todos los casos los restos de Glc fueron removidos y no aparecieron en las glicoproteínas maduras. Se han hecho algunos estudios en sistemas libres de células con microsomas dehígado de rata para estudiar estas reacciones de glucosilación de oligosacáridos unidos a glicoproteínas [10]. En ellos se aprovecharon los aceptores endógenos presentesen los microsomas utilizados comofuente de actividad glucosilante. Con el objeto de estudiar en detalle esta nueva reacción de procesamiento deglicoproteínas ampliamente distribuida en la naturaleza, en el presente trabajo de Tesis se desarrolló un ensayo in vitro específico para esta serie de reacciones. El ensayoutiliza UDP-[14C]Glc como sustrato dador de restos de Glc radioactivos y unaglicoproteína con oligosacáridos de tipo polimanosa como sustrato aceptor. Las glicoproteínasdeben estar desnaturalizadas para poder actuar como aceptoras. Lareacción necesita Ca++y pH neutro. Mediante este ensayo se detectó la actividad de glucosiltransferasa en microsomasde hígado de rata, porotos, Mucor rouxii, Crithidia fasciculata y Trypanosornacruzi. En el ensayo de actividad de la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa, elresto de Glc es transferido en el mismo tipo de unión α(1,3) y al mismo resto de Manque en el intermediario Glc1Man9GlcNAc2-P-P-dolicol. En Crithidia fasciculata, Leptomonas samueli y Trypanosoma cruzi se encontró una actividad equivalente ala glucosidasa II de otros eucariontes pero no se encontró actividad de glucosidasa I. Estos resultados sugieren que la glucosidasa II es la enzima que hidroliza in vivo losrestos de Glc transferidos por este mecanismo. La actividad se localizó por fraccionamiento subcelular en el retículo endoplásmico. Utilizando vesículas microsomales intactas de hígado de rata se caracterizóa la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa como una proteína soluble delinterior del retículo endoplásmico: Mostró latencia para la glucosílación de un aceptorexógeno y fue resistente a proteólisis en dichas vesículas. Se la pudo extraersoluble en medio isotónico con bajas concentraciones de detergentes, mediante métodos mecánicos sin utilizar detergentes y con pH alcalino. Se extrajo en la faseacuosa por partición con Triton X-114. La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata se purificó ahomogeneidad. En electroforesis desnaturalizante en medio reductor corrió como una única banda de peso molecular aparente 160 kDa y en condiciones nativas se comportócomo un homodímero. La enzima pura exhibió las mismas propiedades observadas en preparaciones crudas al desarrollar el ensayo in vitro: pH óptimo neutro,requerimiento absoluto de Ca++ para su actividad y de UDP-Glc como dador de Glc. Reconoció como sustrato aceptor únicamente a glicoproteínas desnaturalizadas yno a las mismas glicoproteínas en estado nativo. Esto no se debió a una diferente accesibilidad del oligosacárido entre la forma nativa y la desnaturalizada sino al reconocimiento por parte de la glucosiltransferasa de algún factor estructural en lasglicoproteínas desnaturalizadas. Se generó un antisuero de conejo contra la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasade hígado de rata capaz de reconocera la proteína desnaturalizada y nativa. Se obtuvo la secuencia de amino ácidos del extremo amino terminal y de fragmentos internos de la glucosiltransferasa de hígado de rata. Los datos previos junto con los presentados en esta Tesis permiten en conjunto confirmar la existencia de un mecanismo de transferencia de un resto de Glc aoligosacáridos de tipo polimanosa en glicoproteínas. La glucosiltransferasa involucrada, una proteína soluble del retículo endoplásmico, reconoce como sustratos a glicoproteínasque aún no han adoptado su estructura nativa. La glucosidasa II hidroliza el residuo de Glc transferido por ésta glucosiltransferasa. Este ciclo de glucosilación-deglucosilación continuaría hasta que las glicoproteínas adoptan su estructura nativa y dejan de ser sustrato de la glucosiltransferasa.
Fil: Trombetta, Eduardo Sergio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.