Caracterización molecular de genes que otorgan tolerancia a estrés en trigo (Triticum aestivum) mediante la aplicación de modernas técnicas de biología molecular - Tacaliti Terlera, María Silvia (2017)
El trigo es uno de los principales cultivos producidos y comercializados mundialmente. Ocupa el 17% de la superficie cultivable del mundo, participa en la alimentación del 40% de la población mundial y provee el 20% del total de calorías y proteínas en la nutrición humana. Se estima que para el año 2050, la producción de granos debería aumentar un 2% anual a fin de satisfacer las necesidades del hombre. Actualmente, se calcula que el cultivo de trigo sufre un 25% de pérdidas de producción debidas a factores bióticos como abióticos. En un contexto productivo en el que no se prevé un aumento significativo de la superficie destinada a la agricultura, resulta prioritaria la protección de este cultivo de importancia mundial y nacional ante los factores de estrés a los que se encuentra sometido. El trigo hexaploide es uno de los genomas vegetales de mayor tamaño ya que contiene 15.966 Mb en total, superando así en 8 veces al del maíz y en 40 veces al del arroz. Se estima que cada genoma del trigo contiene entre 40.000 y 50.000 genes, aunque su complejidad radica en que más del 80% de su ADN consiste en secuencias repetidas, principalmente transposones y retro-transposones. A pesar de tener los cromosomas por triplicado, sus genes son específicos de cada cromosoma. Dada la gran complejidad de este genoma, la secuenciación completa del trigo no es aún pública. Tanto los estreses abióticos como bióticos, desafían un amplio rango de respuestas propias de las plantas, desde la alteración de la expresión génica y cambios en el metabolismo celular, hasta modificaciones en el crecimiento y desarrollo de las plantas, con la consiguiente variación en el rendimiento de los cultivos. Las fitohormonas son responsables de activar los genes de defensa involucrados con eventos de estrés. Luego de que un organismo patógeno o un insecto genera un daño, la planta responde mediante el incremento de la síntesis endógena de ácido abscísico (ABA), giberelinas, etileno (ET), ácido jasmónico (AJ), ácido salicílico (AS), citocininas, brasinoesteroides y hormonas peptídicas, sustancias directamente relacionadas con la interacción planta-predador. Estas moléculas desempeñan un rol preponderante en la regulación de los mecanismos de resistencia. Ha sido probada la relación entre las fitohormonas y las respuestas defensivas en las plantas, como así también la inducción de ciertos genes de respuesta luego de aplicaciones exógenas fitohormonales. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a través de los cuales las plantas integran los cambios inducidos por estrés en los niveles hormonales e inician las respuestas adaptativas no están completamente elucidados. El presente estudio trata de caracterizar molecularmente un segmento localizado en el brazo corto del cromosoma 6A de trigo pan (Triticum aestivum) involucrado con la tolerancia a áfidos. Para ello se trabajó cruzando dos líneas progenitoras (M y P) doble haploides recombinantes (DHR) seleccionadas por ser contrastantes para los marcadores Xgwm334a y Xgwm459, ambos ubicados en dicho segmento cromosómico. Se obtuvieron las generaciones subsiguientes para conocer si el efecto de los tratamientos se mantenía en la descendencia. Las plantas fueron asperjadas con ET, AS, ABA y AJ así como también a través de infestaciones con el pulgón ruso del trigo (RWA), se inició la caracterización a nivel isoenzimática y a través de sus parámetros de crecimiento. Luego se estudió la expresión de un factor de transcripción (NAC2) como gen candidato en las líneas progenitoras tratadas, a fin de caracterizar un gen inducido por los tratamientos aplicados. Los patrones de estearasas difirieron en el tejido aéreo o radical mediante la inducción con las fitohormonas ET, AS, ABA y AJ en las líneas DHR para el cromosoma 6A. El ET silenció las estearasas provenientes de la parte aérea del 58% de las líneas DHR. En los cereales, la relación entre los niveles de actividad de los antioxidantes y la tolerancia al estrés ha sido establecida en plantas sometidas a estrés. Las líneas progenitoras evaluadas en este estudio (M y P) mostraron que los contenidos de ácido ascórbico (total y reducido) y de peroxidasas no fueron modificados cuando fueron tratadas con ET, ABA y mediante la infestación con el pulgón ruso del trigo. En conclusión, ambos sistemas antioxidantes no evidenciaron una actividad o contenido diferenciales respecto de los testigos sin tratar, y por lo tanto no constituyeron un buen indicador de tolerancia al estrés en los materiales ensayados. Las dos líneas progenitoras (M y P), las F1, las F2 y un grupo selecto de plantas F3 fueron caracterizadas por su grado de tolerancia/ susceptibilidad según la longitud del coleoptilo medida a las 24 h posteriores al tratamiento exógeno con ET. Dado que el efecto del ET sobre el crecimiento de las plantas se asocia con la restricción en la elongación de las células, y por ende con la inhibición de la elongación del hipocótilo, se pudo caracterizar a la línea M como tolerante y a la línea P como susceptible según la variación de la tasa de crecimiento del coleoptilo por efecto del ET. Las generaciones F2 y F3 mostraron diferencias altamente significativas en el crecimiento relativo de sus integrantes, según su caracterización como susceptibles, medias y tolerantes. Con el propósito de conocer el comportamiento ante la acción del pulgón ruso de las líneas de trigo M, P y de sus descendientes F1 y F2, se pudo probar que la acción del insecto afectó diferencialmente los parámetros de crecimiento de estos genotipos. La inducción de las defensas de las plantas por efecto del pulgón ruso fue evidenciada a través de los cambios manifestados mediante el contenido de clorofila, la tasa de crecimiento, el peso fresco, el estriado y el enrollamiento de las hojas de las distintas generaciones filiales. Se observó que los genotipos tolerantes mostraron en todos los casos crecimiento compensatorio, aunque esto no se observó en los genotipos susceptibles. Por lo tanto, se comprueba que los genes responsables de crecimiento compensatorio son inducidos por la infestación con el pulgón ruso del trigo. Un grupo de plantas F3 (obtenidas a partir de la autofecundación de plantas F2 seleccionadas por su crecimiento compensatorio o su inhibición, ante aplicaciones de ET) en estado de macollaje fue caracterizado de acuerdo a su crecimiento diferencial inducido por tratamientos exógenos con las hormonas AJ y ABA. A través de los cambios observados en el contenido de clorofila, en el peso seco y en el rebrote pos corte se pudo demostrar que las defensas fueron inducidas. Aquellas plantas que evidenciaron valores superiores al de sus testigos en estos parámetros serían las que lograron encender sus sistemas de defensa eficientemente, sobreponerse al mayor costo metabólico que implica el mantenimiento de dicho sistema y, en consecuencia, crecer diferencialmente. Finalmente, puede afirmarse que los genes responsables del crecimiento compensatorio fueron inducidos por la aplicación externa de las fitohormonas AJ y ABA. Los genes NAC son específicos y muy abundantes en las plantas. Constituyen una de las mayores familias de factores de transcripción que funcionan en las regiones promotoras de diferentes genes relacionados con el estrés. Bajo condiciones de estrés biótico o abiótico, los genes relacionados con las defensas de las plantas presentan un patrón de expresión específico, de modo tal que su sobreexpresión o supresión pueden incrementar la tolerancia de las plantas a ambos tipos de estrés. Para las líneas progenitoras evaluadas, se observó que el tratamiento con ABA aumentó significativamente la expresión del gen NAC2 en la línea M, mientras que el tratamiento con ET tuvo el mismo efecto en la línea P. Por el contrario, el ataque del pulgón no provoca mermas ni incrementos en la expresión del gen candidato, lo que estaría poniendo en evidencia la tolerancia de estas líneas al áfido. La utilización de las defensas de las plantas en la mejora de los cultivos resulta promisoria desde el punto de vista ecológico. El hecho de comprender la naturaleza de la expresión de los genes relacionados con las características defensivas de las plantas será de importancia en el diseño de plantas cultivadas más tolerantes a los herbívoros, con la consecuente disminución de pesticidas tóxicos empleados normalmente para el control de las plagas en los cultivos. Por último, la identificación del gen NAC2 cercano a los microsatélites Xgwm459 y Xgwm334a en el cromosoma 6AS del trigo permitirá su empleo como marcador altamente asociado en la obtención de plantas tolerantes al estrés.