Enfermedad de Parkinson: Modificaciones oxidativas y su rol en la toxicidad de α-sinucleína - Giménez, Ezequiel (2022)
La Enfermedad de Parkinson (EP) se incluye dentro de un grupo de patologías neurodegenerativas conocidas como Sinucleopatías, cuya principal característica es la presencia de agregados amiloides de la proteína α Sinucleína (aSyn). Se ha vinculado una ganancia de función tóxica por parte de aSyn con el desarrollo y progreso de la EP. Sin embargo, la identidad de las especies tóxicas de aSyn es aún desconocida. En este contexto, varias modificaciones postraduccionales (PTM) asociadas al estrés oxidativo podrían ser potenciales moduladores de la fisiopatología de aSyn en neuronas. Así, el presente trabajo se centra en la generación y caracterización de especies modificadas de aSyn en residuos de Tirosina (Tyr), con el propósito de dilucidar sus roles en la EP y otras Sinucleopatías. Inicialmente, nos enfocamos en la optimización de las condiciones para la nitración y entrecruzamiento de Tyr libre por métodos fotoquímicos que usan Rutenio (II) Tris (bipiridina) como fotosensibilizador, incluyendo el análisis de reacciones secundarias y la interferencia de otros aminoácidos. Previo al empleo en aSyn, confirmamos la capacidad del método PICUP modificado para la nitración de proteínas modelo mediante técnicas espectroscópicas y espectrometría de masas. Modificamos aSyn recombinante empleando los métodos foto-inducibles optimizados y caracterizamos las especies generadas por espectroscopia y espectrometría de masas. Se analizaron tres conformaciones alternativas: aSyn desordenada libre en solución, unida a vesículas unilamelares pequeñas (ricas en estructura de hélice), y formando parte de fibras amiloides (ricas en estructura cross-β). Los entrecruzamientos de aSyn libre en solución involucraron principalmente a Y39 y residuos del C-terminal (Y133 o Y136). Por otro lado, todos los residuos de Tyr se identificaron como nitrados, siendo Y125 el más susceptible a la nitración. Tanto al interaccionar con vesículas aniónicas, como cuando forma parte de agregados amiloides, la modificación de Y39 se vio restringida. La nitración de residuos del C-terminal sólo se redujo en presencia de vesículas aniónicas, no así en el caso de los agregados. Estos resultados resaltan que la susceptibilidad de los residuos de Tyr a ser oxidados depende de su estado conformacional y de los componentes con los que interactúan, sugiriendo un mecanismo para la aparición de variantes con diferentes PTM y potenciales especies tóxicas. Finalmente, las especies modificadas de aSyn se analizaron en términos de su capacidad de agregar, interaccionar con membranas y promover la citotoxicidad. Las especies nitradas y entrecruzadas no mostraron capacidad de agregar y bloquearon la tendencia a la agregación de la proteína sin modificar. Además, también se observó la alteración de la interacción con membranas. Por último, estas especies no exhibieron un comportamiento tóxico en células BV-2; por otro lado, la variante nitrada resultó ser tóxica para las células SH-SY5Y diferenciadas, aunque no se observaron diferencias con respecto a la proteína sin modificar. En conclusión, modificaciones particulares, como la nitración de Y39 y el entrecruzamiento Y39-Y133/136, podrían ser responsables de cambios conformacionales y funcionales que lleven a la ganancia de función tóxica de aSyn. Si estas modificaciones pudiesen ser efectivamente correlacionadas con rasgos patológicos a nivel subcelular y/o con la progresión de la EP, su identificación en muestras biológicas complejas podría ser empleado para el desarrollo de herramientas innovadoras para el diagnóstico temprano de Sinucleopatias, su monitoreo, y la evaluación de la eficacia de potenciales tratamiento.