Diagnóstico molecular y epidemiología de las parasitosis intestinales de importancia sanitaria en Argentina: su aplicación en diferentes escenarios de vulnerabilidad - Servián, Andrea (2023)
Las infecciones parasitarias intestinales son causadas por protozoos y helmintos con ciclos de vida específicos dentro del hospedador, y aunque su tasa de mortalidad es baja, representan una importante carga de morbilidad a nivel mundial, especialmente en términos de crecimiento, desarrollo y capacidad laboral. La gravedad de la infección depende de diversos factores, como la especie de parásito, el estado nutricional de los individuos y características socio-económicas de la población. Estas infecciones son más prevalentes en las infancias, pero también afectan a los adultos, especialmente en zonas donde se combinan múltiples aspectos de vulnerabilidad socioeconómica y ambiental, como la pobreza y la falta de acceso a servicios de saneamiento. En Argentina, estas condiciones son comunes en las minorías (étnicas y/o culturales), en las poblaciones que viven en asentamientos o barrios populares en la periferia de las grandes ciudades. En este contexto, es esencial llevar a cabo el estudio de las parasitosis intestinales mediante el uso de técnicas confiables y considerando las particularidades de cada población, ya que esto permite una identificación y comprensión más precisa de la dinámica de estas infecciones. Respecto del diagnóstico, las técnicas convencionales de microscopía son de bajo costo y permiten detectar una amplia gama de parásitos intestinales, mientras que las técnicas moleculares, como la PCR, son más sensibles y específicas. Esto último, permite una diagnosis más precisa, particularmente en casos en los que los estadios de los parásitos hallados en la materia fecal son morfológicamente idénticos, tales como los huevos de Ancilostomídeos o quistes de Entamoeba spp. Tambien son útiles en parasitos como Blastocystis sp. y Giardia lamblia, organismos altamente prevalentes en las poblaciones humanas, que se caracterizan por su diversidad genética, y requieren de métodos especiales para su determinación. En este marco, la presente investigación propone que la aplicación combinada de estas metodologías permite obtener un mayor conocimiento del perfil parasitológico de las poblaciones, el cual esta estrechamente relacionado con las condiciones socio-ambientales y culturales que las caracterizan. Se estudiaron poblaciones de diferentes áreas de Buenos Aires (Gran La Plata y Conurbano bonaerense) y Misiones (población cosmopolita y comunidad Mbyáguaraní), seleccionadas como representantes de diferentes escenarios de vulnerabilidad. El estudio fue de tipo transversal, observacional, e incluyó 948 individuos de ambos sexos de 0 a 80 años, analizados en el período 2017-2021. Los muestreos se realizaron en centros de referencia (comedores barriales, centros culturales e instituciones educativas). En estos sitios, se realizaron talleres de intercambio de saberes sobre las parasitosis intestinales. En el capítulo I, se evaluaron cuatro métodos de extracción en función de la cantidad y calidad de ADN, eficiencia de amplificación, tiempo de procesamiento y costo por muestra. Entre los métodos evaluados se encuentran: uno basado en la extracción con fenol-cloroformo, dos kits comerciales, Qiagen y Zymo, ampliamente utilizados y reportados en bibliografía, y el kit comercial PB-L, una marca nacional de reciente producción. Se utilizaron 10 muestras fecales frescas de individuos con diagnóstico morfológico negativo de enteroparásitos que a su vez fueron contaminadas con epimastigotes de Trypanosoma cruzi, protozoo seleccionado para realizar los controles de extracción. El rendimiento y la pureza del ADN genómico total se compararon espectrofotométricamente. Las mediciones del rendimiento y la pureza del ADN exhibieron variaciones entre los cuatro métodos probados. El método fenol-cloroformo exhibió la mayor cantidad de ADN y una calidad comparable a la del kit Qiagen. Aunque dicho método representó el menor costo, resultó el de mayor tiempo de procesamiento, lo cual aumenta la posibilidad de arrastre de contaminantes al incrementarse el número de muestras que se procesan. Los resultados de la PCR mostraron que todos los kits eran uniformemente eficientes para extraer ADN de epimastigotes de T. cruzi. Por otro lado, se comparó la calidad, cantidad y eficiencia de amplificación de ADN obtenido a partir de muestras fecales almacenadas en dos condiciones distintas: congeladas y almacenadas en etanol 70% durante una semana. Los resultados no mostraron diferencias entre las dos condiciones para ninguna de las variables medidas. El capítulo II se subdivide en cuatro secciones que abordan el diagnóstico molecular diferencial, por un lado, de los helmintos del grupo Ancilostomídeos (Necator americanus y Ancylostoma duodenale), y por el otro de los protozoos Entamoeba spp., Blastocystis sp. y G. lamblia. En la sección II.a, se ensayaron reacciones de PCR con primers específicamente diseñados para N. americanus y A. duodenale. Se comparó la sensibilidad analítica de la PCR desarrollada in house con una PCR semi-anidada reportada en bibliografía para el diagnóstico de N. americanus, encontrando que la primera permite un diagnóstico con la misma sensibilidad, pero en menor tiempo. Por otra parte, la PCR aquí desarrollada se comparó con las técnicas de sedimentación de Ritchie y flotación de Willis, consideradas como pruebas de cribado. Se determinó una mayor sensibilidad de la PCR en un análisis que incluyó 140 muestras fecales seriadas obtenidas de individuos nativos de la provincia de Misiones y una comunidad inmigrante de Paraguay asentada en Buenos Aires. La prevalencia observada de Ancilostomídeos según las pruebas de cribado y el método PCR fueron de 24,3 y 32,8%, respectivamente. Las muestras positivas de PCR se identificaron como N. americanus. Un total de 12 muestras de individuos con miembros de la familia infectados con Ancilostomídeos fueron positivas solo por PCR. Por último, se realizó un análisis filogenético con secuencias parciales del gen mitocondrial cob de N. americanus. Las mismas mostraron un 90,5% de identidad, siendo más similares entre sí que en comparación con las secuencias obtenidas de GenBank. Finalmente, el uso complementario de la técnica de Ritchie y de flotación de Willis para detectar infecciones por Ancilostomídeos, seguido de PCR para diferenciar las especies, contribuyó a estimar de una manera más precisa los valores de prevalencia. En la sección II.b, se ensayaron reacciones de PCR y secuenciación para realizar un diagnóstico diferencial y más certero de Entamoeba spp. a partir de lo identificado morfológicamente por Ritchie y flotación de Willis en muestras fecales seriadas preservadas en alcohol 70% de poblaciones de Buenos Aires (N=517) y Misiones (N=366). La prevalencia global de infección por Entamoeba spp. fue de 12,2%, siendo más prevalente en Misiones que en Buenos Aires (15,0% vs. 10,2%). Un caso de infección mixta por E. histolytica y E. dispar, confirmado por PCR y secuenciación, fue reportado por primera vez en Buenos Aires. Además, se registraron datos genéticos sobre E. coli y E. hartmanni. Los ensayos moleculares revelaron que la observación microscópica sobreestimó la prevalencia de especies del Complejo Entamoeba. El análisis filogenético reveló una congruencia entre las características morfológicas y las secuencias parciales del gen 18S. Lo desarrollado en este capítulo proporciona información novedosa sobre la distribución y datos genéticos de estas especies en Argentina y en la región de las Américas, donde aún son escasos los estudios de prevalencia molecular. En la sección II.c, se exploraron ensayos moleculares para la identificación y tipificación de Blastocystis sp. y se discutió su aplicabilidad en estudios de diagnóstico y prevalencia. En primer lugar, se llevó a cabo la técnica de PCR-secuenciación utilizando primers previamente reportados en la bibliografía, dirigidos a la subunidad menor del ADN ribosomal. Esta técnica permitió identificar los subtipos 1, 2, 3 y 8 y realizar un análisis filogenético comparando con otras secuencias disponibles en la base de datos GenBank. Sin embargo, estos primers también mostraron amplificación y secuenciación de ADN fúngico, con lo cual no resultan útiles para estudios de diagnóstico y de estimación de prevalencia. En segundo lugar, se diseñaron primers específicos para la identificación de Blastocystis sp. a partir de datos de genoma completo de cada subtipo y el contraste con secuencias de géneros de hongos que forman parte de la microbiota intestinal humana, como Candida spp. y Saccharomyces spp. Se demostró su especificidad en ensayos de PCR y por comparaciones bioinformáticas. Por último, se empleó la estrategia de metabarcoding diseñada para la detección de Blastocystis sp. a través de diferentes juegos de primers que amplifican regiones conservadas del gen 16S y 18S. Se determinó la presencia del protozoo en las muestras analizadas e incluso en aquellas que no tenían un diagnóstico morfológico positivo para el protozoo de interés, mostrando la mayor sensibilidad de esta herramienta. Esta técnica permitió, además, reflejar la diversidad de taxones, incluyendo otros organismos eucariotas, bacterias y hongos. En el capítulo II.d se caracterizaron cinco aislamientos de G. lamblia obtenidos de individuos de Buenos Aires y uno de Misiones. Para ello, se amplificó una región parcial del gen 18S y se secuenciaron los amplicones obtenidos. Se realizó la caracterización mediante el alineamiento y análisis filogenético de las nuevas secuencias y aquellas reportadas como de referencia para cada ensamblaje. Se determinó que cuatro pertenecían al ensamblaje A (tres de Buenos Aires y uno de Misiones) y dos al ensamblaje BIV (ambos de Buenos Aires). La región amplificada no permitió resolver el ensamblaje A. En el capítulo III, se determinó la distribución de las parasitosis intestinales presentes en niños y adultos a través de técnicas convencionales y moleculares en diferentes escenarios vulnerables de las provincias de Buenos Aires y Misiones. Es decir, que este apartado integra los resultados obtenidos por las metodologías moleculares (desarrolladas en el capítulo II) con los resultados obtenidos mediante las técnicas basadas en microscopía (e.g. Ritchie, flotación de Willis, escobillado anal). Se describió así una prevalencia de 54,4% para la población en su conjunto y se registraron hasta 16 especies parásitas. La prevalencia registrada en Buenos Aires fue mayor que la de Misiones (57,6% vs. 50,6%). Sin embargo, la mayor diversidad y riqueza parasitaria se halló en esta última provincia. Dentro de Buenos Aires, no se hallaron diferencias significativas entre el área del Gran La Plata y el Conurbano bonaerense, registrándose valores en torno al 50% en ambos sitios. Un valor de prevalencia similar se halló para las poblaciones de Misiones que no se correspondían con las comunidades Mbyá. En esta última la prevalencia parasitaria general fue significativamente mayor, así como también fue superior la prevalencia de helmintos para esta comunidad. En estas determinaciones, por un lado, las herramientas moleculares permitieron establecer diagnósticos especie-específicos y disminuir el número de falsos negativos. Por otro lado, las técnicas morfológicas contribuyeron a realizar un cribado de un gran número de especies para las cuales no se establecieron PCRs específicas. En el capítulo IV se presentó una descripción detallada de las poblaciones analizadas en términos de sus características individuales, socioeconómicas y ambientales, y evaluó su relación con el riesgo de infección parasitaria. Se encontró que la mayoría de los individuos residían en viviendas precarias, en condiciones de hacinamiento y eliminaban las excretas a través de pozo ciego. El trabajo informal fue el tipo de trabajo más común en ambas provincias, siendo la proporción de desempleo mayor entre los individuos de Misiones. La prevalencia de infección parasitaria no mostró una relación significativa con la edad. Sin embargo, la infección por G. lamblia fue significativamente más frecuente en niños menores de 14 años, mientras que Blastocystis sp. presentó mayor prevalencia en los adultos. En ambas provincias, la fuente de agua y el sistema de eliminación de excretas influyeron en la infección parasitaria, mientras que otras variables como el hábito de andar descalzo y prácticas como el huerto y la cría de animales fueron exclusivas de Misiones. En este trabajo comprobamos que el estudio de las parasitosis intestinales adquiere un valor significativo no solo por las consecuencias directas sobre la salud, sino porque permiten estudiar la vulnerabilidad de base de las poblaciones. Los resultados en su conjunto mostraron que la incorporación de las técnicas moleculares permitió establecer un perfil parasitológico de las poblaciones estudiadas con mayor número de parásitos identificados a nivel especie-específico respecto de la descripción basada únicamente en la observación morfológica.