Caracterización de módulos de unión a carbohidratos (CBM) en frutilla : Efecto de su sobreexpresión sobre el fruto - Sin, Ignacio (2017)
Uno de los factores determinantes de la calidad y vida poscosecha de frutos carnosos es su firmeza, impuesta en gran medida por la resistencia mecánica que ofrece la pared celular vegetal. El fenómeno del ablandamiento de frutos es un proceso altamente regulado en el que participan diversos actores en forma concertada y redundante. El objetivo general del presente trabajo de Tesis fue desarrollar una estrategia que permita controlar el metabolismo de la pared celular vegetal en forma global haciendo uso de módulos de unión a carbohidratos (CBM), de modo tal de mantener la integridad de la pared, con un concomitante retraso en el ablandamiento del fruto. Dada la relevancia del metabolismo de pectinas en el ablandamiento de frutilla, se centró el estudio en CBM provenientes de proteínas conocidas por participar de dicho metabolismo, como la expansina dos (FaEXP2) y la α-L-arabinofuranosidas uno (FaARA1), ambas de frutilla. Las expansinas (EXPs) pertenecen a una amplia familia de proteínas de origen diverso, pudiendo encontrárselas en plantas, varias especies de hongos y bacterias. Son relevantes para el metabolismo de la pared celular y cumplen un rol de importancia en el proceso de maduración y ablandamiento de frutos carnosos. Si bien es posible identificar un dominio catalítico similar al de las glicosil hidrolasas en la secuencia de estas proteínas, a la fecha no se les ha comprobado actividad hidrolítica alguna. Sin embargo, se ha demostrado que son las responsables del fenómeno conocido como “crecimiento ácido”, en el que, a pH ácido, inducen la relajación de paredes celulares aisladas aumentado su tasa de estiramiento ante un esfuerzo constante. La evaluación de su actividad biológica es dificultosa, dado que se realiza mediante un bioensayo en el cual se miden parámetros mecánicos de la pared celular vegetal. Los pocos intentos destinados a la caracterización de la actividad de estas proteínas se han llevado a cabo usando extensómetros no comerciales, diseñados y construidos especialmente para tal fin, lo cual ha restringido significativamente su estudio a unos pocos laboratorios en el mundo. Las α-L-arabinofuranosidasas (α-L-AFasas EC 3.2.1.55) son enzimas involucradas en el catabolismo de diversos polisacáridos de la pared celular vegetal, tales como pectinas y hemicelulosas, catalizando la hidrólisis de residuos de α-L-arabinofuranosidos no reductores. Análisis bio-informáticos de las secuencias aminoacídicas de las α-L-arabinofuranosidasas de Fragaria x ananassa predicen la presencia de un dominio de unión a carbohidratos de la familia CBM_4_9 en estas proteínas, asociado con afinidad por diversos carbohidratos. En el segundo capítulo de la tesis se describe la adaptación de un texturómetro comercial a la medida de la actividad expansina usando un método basado en el fenómeno del crecimiento ácido, con el objetivo de desarrollar un protocolo que permita evaluar en forma cuantitativa la actividad de estas proteínas durante el proceso de maduración de frutos de Fragaria. En el tercer capítulo, se analiza la posibilidad de utilizar la sobre-expresión del módulo de unión de carbohidratos de la expansina dos de Fragaria x ananassa (FaEXP2) para controlar el fenómeno de ablandamiento usando Fragaria vesca cv Hawaii 4 como sistema modelo. La idea central es que la expresión de una proteína con la capacidad de unirse a carbohidratos, pero carente de actividad hidrolítica sobre los mismos, generaría una competencia por el sustrato con el resto de las enzimas involucradas en el metabolismo de la pared celular, lo cual provocaría una reducción global del metabolismo de la pared celular. Se analizan distintos parámetros de calidad, la expresión de genes relacionados con el metabolismo de la pared celular y la actividad expansina y poligalacturonasa en frutos transgénicos sobreexpresantes de CBM-FaEXP2. En el cuarto capítulo, se presenta la caracterización del perfil de afinidades del CBM putativo de la enzima α-L-arabinofuranosidasa 1 de Fragaria x ananassa (CBM-FaARA1). La secuencia correspondiente al CBM predicho se clonó y expresó en células de E. coli. La proteína recombinante resultante se purificó a partir de agregados proteicos (cuerpos de inclusión) por medio de una cromatografía de afinidad al níquel en condiciones desnaturalizantes. La proteína recombinante purificada y replegada se sometió a ensayos de unión a carbohidratos y electroforesis en geles de retardo, encontrándose que la misma posee afinidad por homogalacturonanos y celulosa.