Caracterización molecular de un virus de la granulosis de Epinotia aporema - Parola, Alejandro Daniel (2004)
El barrenador de los brotes de la soja, Epinotia aporema (Lep. Tortricidae) es una importante plaga de leguminosas en América del sur. En Argentina, este insecto ocasiona reducciones en los rindes de soja de hasta el 40%. Estudios preliminares identificaron a un Granulovirus (EpapGV) como un candidato potencial para el control biológico de Epinotia aporema. En esta tesis se aborda la caracterización molecular de EpapGV. Los análisis de microscopía electrónica (ME) de los cuerpos de inclusión (OBs) de EpapGV indicaron que éstos son ovoides con tamaños de 469 (± 37) nm x 242 (± 22) nm y que contienen un virión con forma de bastón, con una única nucleocápside. El OB está formado mayoritariamente por una proteína de 28,5 ± 0,5 kDa cuya secuencia amino-terminal es muy similar a otras granulinas de los Granulovirus. El mapa de restricción del genoma de EpapGV se determinó a partir del análisis de una biblioteca de fragmentos del DNA de EpapGV mediante digestiones con enzimas de restricción, Southern blot y amplificaciones de PCR con primers que apuntaban hacia afuera de los fragmentos virales. Esta última técnica se empleó para asegurar la contigüidad de los fragmentos. El tamaño del genoma se estimó en 120 kbp y se posicionaron los sitios EcoRI, BamHI, Hindlll y Bglll en el mapa físico. El gen de granulina ubicado en el mapa físico por Southern blot, fue clonado y seCuenciado. Este gen tiene 747 nucleótidos de largo y codifica para una proteína de 29 kDa. La secuencia amino terminal deducida de la secuencia nucleotídica coincidió con la secuencia proteica determinada por degradación de Edman, salvo por la ausencia del residuo de la metionina inicial. El análisis de la secuencia 5' permitió detectar una secuencia promotora tardía característica de este gen (ATAAG) ubicada 29 pb upstream al ATG; además, se describió un posible motivo transcripcional situada entre el promotor y el ATG (WCARNA). El análisis de la presencia de genes inhibidores de apoptosis (iap) mediante Southern blot, identificó una región genómica que codifica para un iap con similitud a los iap-3 de los baculovirus. Este gen codifica para un polipéptido de 256 aminoácidos y su secuencia presenta dos motivos BIR y un motivo RING-Finger característicos de estas proteínas. Por otra parte, un análisis filogenético agrupó a EpapGV IAP-3 con proteínas IAP-3 de baculovirus y de lepidópteros. La caracterización de las secuencias parciales del genoma de EpapGV (aproximadamente un 30% del genoma), reveló la presencia de 36 ORFs con homólogos en otros organismos. Por otra parte, se localizaron seis secuencias repetidas del tipo palíndromes imperfectos, distribuidas en diferentes lugares del genoma y repeticiones pequeñas situadas en regiones 5' no codificantes de varios genes. La presencia de ORFs compartidos por pares de fragmentos se usó, entre otras cosas, para confirmar la contigüidad de fragmentos en el mapa físico. El análisis filogenético de los baculovirus obtenido a partir de apilamientos de proteínas mayoritarias de cuerpo de inclusión coincidió con el árbol filogenético generado a partir del alineamiento de 20 proteínas conservadas en todos los baculovirus de lepidópteros totalmente secuenciados. Los resultados indicaron que EpapGV pertenece al grupo I del género Granulovirus y esta muy relacionado con CpGV, pero posee una organización génica diferente. En otro orden de cosas, se ha puesto a punto un ensayo de ELISA de captura para la detección y cuantificación de rutina de EpapGV, basado en anticuerpos policlonales específicos para granuiina de EpapGV. Este ensayo posee una alta sensibilidad para EpapGV, detectando hasta 0,53 ng/ml de granuiina, equivalentes 1.000 OBs por fosa. El ensayo de ELISA permitió cuantificar OBs de EpapGV en diluciones que contenían hasta 5 x 103 OB por pg de formulado bioinsecticida. Por otra parte, el ensayo se utilizó para determinar el progreso de la infección en larvas, estableciendo la presencia de granuiina a partir de las 24 h p.i. Los resultados de esta metodología indicaron que la misma es una alternativa rápida y barata para la detección y cuantificación de rutina de EpapGV en mezclas complejas. En conclusión, se ha provisto evidencia sustancial sobre el genoma de EpapGV y de su proteína mayoritaria del cuerpo de inclusión. Estos datos avalan la clasificación tentativa del virus aislado de E. aporema dentro del género Granulovirus de la familia Baculoviridae. Finalmente, estos estudios en conjunto con otros realizados por nuestro equipo de investigación, sientan las bases para el registro comercial de este virus que permitirán en el futuro, su uso en agricultura como agente de control biológico de E. aporema.