Regulación dinámica del traductoma de Medicago truncatula durante la simbiosis fijadora de nitrógeno - Traubenik, Laura Soledad (2020)
La capacidad de las leguminosas de establecer una asociación simbiótica con bacterias fijadoras de nitrógeno es de fundamental importancia para la incorporación de nitrógeno en los suelos. Si bien en los últimos años se ha avanzado en la identificación de genes de la planta requeridos para la nodulación, aún se desconocen muchos aspectos de los mecanismos moleculares que regulan un proceso complejo, en el que se integran y coordinan la infección de la bacteria, el desarrollo de un nuevo órgano en la raíz de la leguminosa y las señales del ambiente. La expresión génica es regulada a múltiples niveles, que involucran eventos nucleares y citoplasmáticos. Los eventos nucleares incluyen la remodelación de la cromatina, la transcripción y el procesamiento del RNA, el control de la calidad de los RNAs y el exporte de los mismos del núcleo al citoplasma. Una vez en el citoplasma, los transcriptos pueden ser traducidos activamente en los polirribosomas, almacenados en complejos ribonucleoproteicos o sometidos a degradación por diferentes mecanismos. El auge de las técnicas asociadas a la transcriptómica ha llevado al uso de los niveles estacionarios de mRNA como criterio para la selección y el estudio de genes con una posible implicancia en caracteres de importancia agronómica. Este enfoque ha excluido los niveles de regulación post-transcripcionales, asociados a una respuesta rápida mediante la activación o represión traduccional de mRNAs preexistentes, así como a la degradación de mRNAs. Este conocimiento es esencial para establecer criterios racionales que permitan optimizar el proceso de fijación biológica de nitrógeno. En el presente trabajo de Tesis se caracterizó a escala genómica la distribución dinámica de la asociación de RNAs mensajeros (mRNAs) y RNAs no codificantes largos (lncRNAs) a la maquinaria traduccional durante las etapas tempranas de la simbiosis. Para ello, se utilizó la técnica Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) seguida de secuenciación masiva de RNA (RNA-seq) en raíces de la leguminosa Medicago truncatula inoculadas o no con su par simbiótico Sinorhizobium meliloti. Un aspecto notable de nuestros resultados fue la limitada correlación entre la regulación a nivel transcripcional y traduccional observada en respuesta a la inoculación con S. meliloti, sugiriendo que el control traduccional contribuye significativamente a la reprogramación de la expresión génica en las células de la raíz comprometidas para la simbiosis. Posteriormente, se evaluaron los niveles de asociación de los mRNAs y lncRNAs a la maquinaria traduccional de tejidos específicos de la raíz involucrados en la formación de nódulos. Este análisis permitió establecer que los cambios de asociación de los RNAs a polisomas están fuertemente determinados por los diferentes tipos de células que participan en las etapas tempranas de la simbiosis. El análisis de las variantes de transcriptos alternativos asociados diferencialmente a la maquinaria traduccional en respuesta a la inoculación nos permitió identificar al transcripto SUPERKILLER 3 (SKI3), el cual codifica una proteína involucrada en la vía de degradación 3´-5´. El silenciamiento de SKI3 alteró el desarrollo de los nódulos y la supervivencia de las bacterias dentro de los mismos. Un mapeo de los RNAs clivados diferencialmente en plantas silenciadas en SKI3 o plantas control utilizando la técnica de GMUCT 2.0, permitió identificar al transcripto que codifica un miembro de la familia de factores de transcripción APETALA2 (AP2) como target putativo de la vía de degradación mediada por SKI3. Dicho AP2 es el ortólogo putativo de NNC1, un represor transcripcional del gen de nodulación ENOD40. Por último, se analizó la dinámica de la asociación de lncRNAs a la maquinaria traduccional durante la simbiosis. Se identificaron lncRNAs que muestran un comportamiento determinado por el tipo celular. Así se identificó al lncRNA intergénico denominado POSEIDON (PSD), el cual disminuye su asociación a la maquinaria traduccional en el córtex de la raíz luego de la inoculación con S. meliloti. El silenciamiento de PSD alteró tanto los eventos de infección como la organogénesis del nódulo, sugiriendo que este lncRNA podría desempeñar una función regulatoria durante la simbiosis fijadora de nitrógeno. El presente trabajo de tesis contribuye a sustentar la relevancia de los niveles de regulación post transcripcional en el control de la expresión génica durante el establecimiento de la asociación simbiótica entre leguminosas y rizobios. Los resultados obtenidos permiten mejorar nuestra comprensión del fenómeno biológico que conduce a la fijación biológica de nitrógeno, a la vez que resultan útiles para aumentar la información en la cual se basa la selección de genes con potencial utilización en el mejoramiento genético de caracteres agronómicos relevantes en plantas leguminosas.