Impacto de velocidades de congelación y coeficientes de transferencia en la viabilidad de semillas cítricas para su criopreservación - Orjuela Palacio, Juliana Marcela (2025)
Argentina cumple un rol relevante en la producción mundial de cítricos, durante 2023-2024 se produjeron 1.7 millones de toneladas (USDA, 2024) y además es el cuarto productor mundial de limones frescos (BID, 2022). La conservación ex situ de germoplasma de especies cítricas es fundamental dado su relevancia en el mercado mundial. Citrus limon L. Burm cv. Eureka es una de las variedades más cultivadas y estudiadas; se clasifica como semilla intermedia en cuanto a su fisiología de conservación, requiriendo una deshidratación hasta alcanzar un óptimo de humedad de 18.8% b.h. (actividad acuosa de aw= 0.64), previo su inmersión en nitrógeno líquido (LN) para su criopreservación (Orjuela-Palacio y col., 2019). La velocidad a la cual se enfrían semillas en nitrógeno líquido es una variable crítica del protocolo de criopreservación y la transferencia de energía durante el proceso influye directamente en la formación de cristales de hielo intracelular y en las transiciones de fase correspondiente a la fusión de lípidos (Orjuela-Palacio y col., 2019). Un conocimiento y control preciso del protocolo es esencial para minimizar el daño estructural a nivel celular, preservando así la viabilidad y estabilidad genética de las semillas durante el almacenamiento congelado. La performance del protocolo de criopreservación está directamente relacionada con las características del proceso de congelación, su velocidad y los coeficientes de transferencia de energía que se establecen entre el objeto y el fluido criogénico. Cuando el nitrógeno líquido, cuya temperatura de saturación a 1 atmósfera es -196ºC, entra en contacto por inmersión con una muestra a temperatura ambiente se produce la ebullición del líquido circundante debido a una diferencia de temperatura muy elevada (>200ºC). En este punto comienza un régimen de ebullición en film (Bui y Dhir, 1985; Santos y col., 2013) donde el flujo de calor desde el objeto hacia el nitrógeno líquido se ve disminuido debido a la presencia de una delgada capa o film de nitrógeno vapor que actúa como aislante retardando el enfriamiento. Al fenómeno de ebullición en film también se lo denomina "efecto Leidenfrost”. El objeto se enfría hasta alcanzar una temperatura donde el flujo de calor es mínimo (Temperatura de Leidenfrost, TL). A partir de este punto el film de vapor se desprende bruscamente y el flujo de calor aumenta de manera progresiva alcanzando un valor máximo donde se establece la transición de régimen a ebullición nucleada. Otro proceso de criopreservación que genera un enfriamiento ultrarrápido consiste en dispersar gotas de fluido criogénico sobre el objeto, también denominada congelación tipo spray. En la congelación spray la transferencia de calor involucra varios mecanismos que pueden darse en simultáneo como son la i) convección, ii) evaporación desde la superficie de la película, iii) ebullición nucleada en la superficie del objeto y iv) nucleación secundaria (Chow y col., 1994). En la literatura científica existe escasa información acerca de los mecanismos que ocurren durante el enfriamiento y los coeficientes de transferencia de calor que gobiernan los procesos de criopreservación, siendo este conocimiento relevante para optimizar la performance de protocolos y la viabilidad de semillas en bancos de germoplasma vegetal. Los objetivos del presente trabajo fueron: a) determinar aplicando las ecuaciones de transferencia de energía y el método de "lumped parameters” los coeficientes de transferencia de energía empleando una pieza metálica con la misma geometría de una semilla, sometida a 3 protocolos de criopreservación con distintas velocidades de congelación, b) medir experimentalmente la viabilidad de las semillas sometidas a los tres protocolos de congelación mediante ensayos de tinción con tetrazolio y correlacionar los coeficientes de transferencia de calor de cada protocolo con los % viabilidad para determinar su performance.