Aplicación de pectinasas a procesos industriales que involucran la producción frutihortícola: PPasa-SE de Geotrichum klebahnii, PGI de Aspergillus kawachii y PGzyme de Asperillus sojae - Franchi, María Luisa (2016)
En el marco del desarrollo de mi plan de tesis doctoral se ha trabajado en la producción y aplicación de pectinasas a diferentes procesos industriales que involucran la producción frutihortícola del Alto Valle de Río Negro. En principio, se pusieron a punto los cultivos alimentados como estrategia para mejorar la producción de la poligalaturonasa PGI recombinante de A. kawachii clonada en S. cerevisiae. La condición de la alimentación en dos etapas con una inducción a 8,8 ml/h para la segunda etapa resultó ser la condición de mayor producción de enzima obteniéndose una actividad final de 77 U/ml y una productividad de 2,40 U/mlh. Además, considerando que una de las fuentes de carbono que usa el medio sintético de cultivo utilizado para expresar a PGI sufrió un fuerte incremento en el precio, la galactosa, se ha trabajado a fin de optimizar los costos de la producción de dicha enzima. Para ello se realizó en el medio de cultivo el reemplazo de galactosa comercial por galactosa obtenida a partir de la hidrólisis enzimática de lactosa. Los productos de reacción obtenidos fueron aproximadamente de un 50% de glucosa, un 45% de galactosa y un 5% de oligosacáridos (calculado por diferencia). La reacción se completó en promedio en un 96%. Al realizar el sistema de lote alimentado con el reemplazo de la galactosa obtenida mediante la hidrólisis de la lactosa, se obtuvo un óptimo crecimiento de S. cerevisiae y producción enzimática a un menor costo. También se estudió la posibilidad de reutilizar los grandes volúmenes de subproductos que generan las industrias frutícolas del Alto Valle de Río Negro para una posterior extracción de pectina con el objetivo de ampliar la gama de productos de alto valor agregado a la oferta local. Considerando que si bien existían datos bibliográficos respecto del contenido de pectina de diversos frutos, pero no estudios referentes a la evaluación del contenido de pectina de los frutos de producción local, el estudio consistió inicialmente en evaluar, mediante extracción química, el contenido de pectina en distintas variedades de manzanas (Gala, Red Delicious, Granny Smith y Pink Lady), peras (Williams, Red D'anjou y Winter Bartlett) y membrillo (Smyrna) de producción en el Alto Valle de Río Negro. Los porcentajes de pectina obtenidos para estos frutos están dentro de los rangos reportados para otros cultivares en otras partes del mundo y pusieron de manifiesto que los frutos podrían ser un buen sustrato para la extracción de pectina con distintos fines. Se analizó la extracción enzimática de pectina por las enzimas de A. kawachii, de G. klebahnii y de A. sojae sobre manzanas y peras regionales. Para evaluar el rendimiento del proceso, se compararon los rendimientos obtenidos con las enzimas en estudio con los obtenidos por tres pectinasas comerciales y con el obtenido por medio de la extracción química. Las enzimas estudiadas se comportaron de igual o mejor forma que las comerciales y se observó que PGI posee mejor capacidad para la extracción de pectina, extrayendo en manzanas un 25%, un 40% y un 60% más que la extracción química, PPasaSE y PGzyme, respectivamente. Y en peras extrajo un 80% más que en la extracción química y que con ambas enzimas. Por último, se caracterizó parcialmente la pectina extraída; mostrando un GE > 50% (pectinas de HM). En cuanto al contenido de ácidos urónicos (principalmente AGA) en el MIE sólo pudo determinarse en el caso de la enzima PGI resultando en aproximadamente 70 y 50% en manzanas y peras, respectivamente. Por otra parte, se realizaron ensayos de maceración por enzimas de G. klebahnii y A. sojae sobre tejidos de zapallo y manzana de la región. En primera instancia, se evaluó el efecto de la concentración enzimática sobre el proceso, encontrándose como actividad final óptima 40 U en la mezcla de reacción tanto para PPasaSE como para PGzyme. Estas enzimas se comportaron de igual o mejor forma que las enzimas comerciales, alcanzándose con ambas un rendimiento en el proceso de ~ 35% y 20% en la fracción de tejido macerado (TM) para los zapallos y manzanas, respectivamente. Debido al creciente interés sobre los compuestos fitoquímicos, que presentan beneficios directos sobre la salud, se decidió determinar la composición y actividad antioxidante de los productos obtenidos en el TM y en el sobrenadante (S). Los resultados mostraron un mayor contenido de azúcares reductores y ácidos urónicos (sustancias pécticas) en el S en todos los casos. El TM de zapallo mostró una actividad antioxidante y un contenido en fenoles totales mayor en el S, demostrando tener una mayor proporción de células dañadas. La actividad antioxidante y el contenido en fenoles totales en las fracciones de TM y S para manzana resultaron similares. Esto indicaría que una fracción alta de células mantuvo su estructura intacta. A partir de estos resultados, puede concluirse que la manzana es mejor sustrato para utilizarlo en la maceración enzimática otorgando un producto de buena calidad nutricional. Se comprobó que las maceraciones mecánicas produjeron con ambos vegetales, productos de baja calidad nutricional, dejando en evidencia las bondades de los procesos enzimáticos. Para el proceso de clarificación de jugo de manzana para la elaboración de sidra mediante el uso de las enzimas PPasaSE y PGzyme, se evaluaron diferentes condiciones de temperatura, concentración de enzima y tiempo mediante el diseño estadístico Doehlert. PPasaSE no presentó una buena capacidad de clarificación, por lo tanto, los cálculos se realizaron con los resultados obtenidos por PGzyme. Las condiciones óptimas resultaron: 20 °C, Enz. 2.2 U/ml y 4.5 hs. Se realizó un análisis comparativo bajo esas condiciones de los rendimientos obtenidos con las enzimas en estudio y con los obtenidos a partir de la aplicación de las enzimas comerciales. Los resultados obtenidos para la clarificación enzimática en porcentaje de clarificación (%C) fueron 56.5 con PPasaSE, 99.4 con PGzyme, 96.5 con BA, 97.6 con J1 y 98.6 con J2. También se comparó la capacidad de clarificación de PGzyme con el proceso tradicional de clarificación de sidras que utiliza bentonita enológica como agente clarificante. Para la clarificación con bentonita el %C fue 76.1 a los 15 días y 99.6 a las 4.5 hs con Bentonita + Enzima (PGzyme). PGzyme demostró excelentes condiciones para su aplicación en procesos de clarificación de jugos, demostrando ser igual o mejor que las enzimas comerciales y mejor que los procesos tradicionales con bentonita, otorgando mejores resultados en menores tiempos. Además, se analizaron los °Brix y pHs de los jugos previamente a la clarificación y posteriormente. La medición de estos parámetros no mostró ningún cambio significativo en el jugo al aplicar el proceso. De esta manera queda demostrado que las pectinasas de producción nacional provistas por el Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales (CINDEFI), Poligalacturonasa (PGI) de A. kawachii, PPasa-SE de G. klebahniiy PGzyme de A. sojae, presentan un amplio potencial de aplicación a diferentes procesos industriales y de particular interés a aquellos que involucran la producción frutihortícola de la región del Alto Valle de Río Negro tales como extracción de pectina, maceración de tejidos, clarificación de jugos y sidra.