Caracterización fenotípica de Bordetella pertussis creciendo en biofilm : Desde la proteómica al reconocimiento molecular de factores de virulencia - Arnal, Laura (2014)
En este trabajo de tesis doctoral y bajo la hipótesis de la utilización por parte la bacteria de Bordetella pertussis del desarrollo en biofilm como un posible mecanismo de persistencia en el hospedador se evaluó la capacidad de formación de biofilm por parte de aislados clínicos de Bordetella pertussis obtenidos de pacientes infectados y tratados en el Hospital Sor María Ludovica de la ciudad de La Plata. Todos los aislados clínicos estudiados, incluyendo cepas aisladas entre los años 2001 y 2007 presentaron mayor capacidad de formación de biofilm en superficies abióticas cuando se las comparó con la cepa de referencia Bordetella pertussis Tohama I, cepa adaptada al laboratorio y utilizada en la producción de vacunas contra la enfermedad. De los ocho aislados clínicos estudiados se seleccionó uno, debido a una exacerbada producción de biofilm (produjo 5 veces más biomasa en las mismas condiciones de cultivo cuando se la comparó con la cepa de referencia) y se realizó un estudio de proteómica comparativa para establecer un posible fenotipo adaptado a la condición de cultivo en estudio. Los experimentos se llevaron a cabo en colaboración con el grupo de la Dra. Monika Elingh Schulz de la Universidad de Veterinaria de Viena, Austria y se utilizó la tecnología 2D-DIGE para evaluar la expresión diferencial de proteínas de la fracción soluble entre ambas cepas en condiciones de cultivo líquido y biofilm. Un análisis de componente principal indicó que las diferencias más significativas entre los fenotipos expresados es consecuencia de la diferencia de cepas y posteriormente consecuencia de la condición de cultivo. Se identificaron 32 proteínas diferencialmente expresadas (mayor de 3 veces de diferencia) entre ambas cepas, las cuales fueron asignadas a las categorías: metabolismo y obtención de energía, síntesis de aminoácidos y proteínas, transporte y virulencia (Bcrh2, OmpQ, Vag8 y BrkA). Todos los factores de virulencia identificados corresponden a proteínas reguladas por el sistema de dos componentes BVGAS. Sabiendo que dicho sistema regula la expresión de importantes adhesinas en Bordetella pertussis y que su inactividad provoca la incapacidad de formación de biofilm es que se decidió estudiar a través de la técnica de PCR en tiempo real la expresión del ARN mensajero de un conjunto mayor de factores de virulencia regulados por este sistema incluyendo adhesinas tales como FHA, PRN, Fim, BipA y la proteína de secreción del sistema tipo III Bsp22 que ha sido reportada en la bibliografía como participante junto a Fim en la producción de filamentos que brindarían estructura a la matriz extracelular del biofilm de B. pertussis. Los resultados obtenidos indicaron un aumento en la expresión de ARN mensajero para la totalidad de los genes estudiados indicando que posiblemente el aumento en la expresión de adhesinas reguladas por el sistema BvgAS, sumado a la expresión de enzimas involucradas en la producción de energía que podrían explicar la alta velocidad de duplicación de la cepa clínica Bp2723 le conferirían la capacidad de formar un biofilm más robusto comparado con la cepa de referencia en las condiciones de cultivo estudiadas.