Participación del óxido nítrico en respuestas de aclimatación a la restricción de fósforo en plantas cultivadas - Luquet, Melisa Luciana (2025)
El fósforo (P) es un macronutriente esencial para las plantas ya que participa tanto en procesos esenciales como la fotosíntesis, la respiración y la señalización intracelular, como también formando parte de componentes estructurales de sus tejidos. Sin embargo, la baja disponibilidad de P en los suelos agrícolas representa una limitante crítica para el desarrollo de los cultivos. Frente a su escasez, las plantas activan respuestas de aclimatación que implican ajustes fisiológicos, morfológicos y moleculares destinados a maximizar la eficiencia en la adquisición y la utilización de P. Comprender estos mecanismos es clave para avanzar hacia una agricultura más sostenible, que permita mantener la productividad con un uso reducido de insumos externos y un menor impacto ambiental. El óxido nítrico (NO) es una molécula gaseosa altamente reactiva con una gran relevancia en procesos de señalización en plantas. Numerosos estudios evidenciaron la participación del NO en vías de señalización responsables de la activación de respuestas de aclimatación a distintos tipos de estrés biótico y abiótico. La generación de esta molécula en las células vegetales sigue siendo causa de investigación y debate, sin embargo, su participación en la regulación de procesos biológicos fundamentales para el crecimiento y desarrollo y la respuesta al estrés ha sido bien documentada a lo largo de más de 40 años de investigación. Trabajos previos de nuestro laboratorio evidenciaron cambios tempranos (24 h) en el proteoma de plantas de soja (Glycine max) expuestas a restricción de P. Los cambios desencadenados sugirieron el ajuste del metabolismo en forma temprana para afrontar condiciones más severas de restricción al nutriente, donde la actividad de la enzima NR y la generación de NO podrían ser mecanismos involucrados en la percepción y respuesta al estrés. Además, tratamientos con un donor de NO (S-nitrosoglutatión) en plantas de maíz (Zea mays) expuestas a restricción de P (hasta 21 días), influenciaron positivamente algunas respuestas típicas de aclimatación a la deficiencia de P, como la actividad fosfatasa ácida (AP) y la acidificaciòn del medio de cultivo de las plantas. Estos resultados permitieron plantear una hipótesis que vincula la generación endógena de NO frente a la restricción de P y la activación de respuestas tempranas de aclimatación a este estrés. En este trabajo de Tesis se utilizaron plantas de soja (Glycine max, cv. Williams 82) para estudiar respuestas tempranas de aclimatación a la restricción de P (hasta las 96 h de tratamiento). Se evaluaron los niveles de NO, las posibles vías involucradas en su síntesis y su vinculación con las respuestas de aclimatación desencadenadas. Las plantas fueron cultivadas en dos condiciones contrastantes de P: solución Hoagland modificada sin el agregado de P (-P) y con 0,5 mM de P (+P), durante 96 h. Se realizó la caracterización del crecimiento y los niveles de P en las plantas durante las primeras horas de restricción de este nutriente (Capítulo I). La concentración de P en las plantas expuestas a restricción de P mostró una disminución significativa en todos los órganos evaluados, alcanzando la caída más drástica en la raíz (R; 68,4 %), seguida de las hojas unifoliadas (HU; 64,7 %), las hojas trifoliadas (HT; 42,3 %) y el resto del vástago (RV; 25,1 %). No obstante, a pesar de esta disminución en los niveles de P, los parámetros fotosintéticos no evidenciaron alteraciones y las plantas no presentaron cambios significativos en el crecimiento durante el período analizado. Se evaluó la generación de NO en las plantas empleando microscopía de fluorescencia en presencia de la sonda DAF-FM DA (Capítulo II). La restricción de P generó un aumento en los niveles de NO en las HU, presentando la mayor diferencia entre tratamientos (+P y -P) a las 72 h, mientras que no se observaron cambios significativos en la generación de esta especie en el ápice de las raíces. Para evaluar las posibles vías involucradas en la generación de NO se realizaron tratamientos con 0,1 mM tungstato de sodio (W), un inhibidor de la actividad de la enzima NR, y 0,5 mM de L-NAME, un inhibidor de la actividad tipo NOS (óxido nítrico sintasa) dependiente de arginina, dos de las actividades extensivamente descritas en literatura como principales fuentes de generación de NO ante distintas situaciones fisiológicas y de estrés. El tratamiento de las plantas de soja con W, pero no con L-NAME, redujo la magnitud de la señal fluorescente vinculada al NO observada en las HU de plantas restringidas en P. Si bien no se descarta la participación de otras fuentes de generación de NO, en las plantas de soja, las HU son sitios de generación de NO bajo condiciones de restricción de P. Para profundizar en este aspecto, se evaluó la actividad de la enzima NR en HU a las 48 y 72 h de restricción de P, con o sin adición de W (0,1 mM). La actividad NR aumentó en las HU de plantas restringidas en P y se correlacionó con la producción endógena de NO en estos órganos. El tratamiento con W logró reducir la actividad NR en las plantas -P a nivel comparable con la actividad evidenciada en las plantas control. Así, la enzima NR parece tener un papel relevante en la generación de NO en esos órganos en etapas tempranas de la restricción de este nutriente. La interacción del NO con fitohormonas en procesos de señalización frente a distintos tipos de estrés, como la deficiencia de P, ha sido documentada. En este trabajo de Tesis se estudiaron los cambios en los niveles de fitohormonas (Giberelinas -GA-, ácido indol-3-acético -IAA-, ácido abscísico -ABA-) desencadenados en las plantas en forma temprana frente a la restricción de P y su posible vinculación con los niveles de NO (Capítulo III). Se evaluó el perfil hormonal de HU y R de plantas controles y expuestas a restricción de P y se observaron cambios en los niveles de GA y de ABA en las R de las plantas restringidas en P que parecen indicar la participación temprana de estas hormonas durante las primeras horas de tratamiento. Se observó una disminución en la concentración de GA3 en las R, aunque sin cambios aún en la elongación de la raíz principal (RP). Por otro lado, el estudio de los niveles de ABA evidenció una buena correlación entre la concentración de esta hormona en las R con la generación de NO en las HU de plantas restringidas en P, mostrando un aumento significativo a las 72 h, respecto de las plantas control. Estudios complementarios empleando plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0 (WT) y mutantes en la síntesis de ABA (aba2-1, deficiente en la conversión de xantoxina a ABA-aldehído; y aba3-1, deficiente en la conversión de ABA-aldehído a ABA) cultivadas en condiciones control (+P) y restringidas en P (-P) permitieron demostrar que el NO se incrementa en las hojas en forma temprana (72 h) en las plantas WT frente a la carencia de P, en concordancia con los resultados obtenidos en plantas de soja. Contrariamente, las plantas mutantes en la síntesis de ABA no mostraron un incremento de los niveles de NO en condiciones de restricción de este nutriente. El tratamiento con ABA exógeno de las plantas de Arabidopsis mutantes en la síntesis de ABA, bajo condiciones de restricción de P, produjo una recomposición de la fluorescencia vinculada al NO en las hojas, similar al observado en plantas WT -P, sugiriendo que la capacidad de la planta para sintetizar ABA sería crucial para activar los eventos que conducen a una producción incrementada de NO en respuesta al estrés por restricción de P. Así en plantas de soja y Arabidopsis, el ABA podría tener un rol en la señalización vinculada a la generación de NO y en la comunicación raíz-parte aérea bajo restricción de P. Se estudiaron algunas respuestas típicas de aclimatación a la restricción de P (Capítulo IV): la actividad AP, la actividad de enzimas ribonucleasas (RNasas) y la acumulación de ácidos orgánicos (AO), las cuales resultaron incrementadas en forma temprana por la restricción de P, particularmente en las raíces de las plantas de soja. El tratamiento de las plantas restringidas en P con W (-P+W), redujo no sólo la actividad de la enzima NR sino también la magnitud de las respuestas de aclimatación observadas al valor control. En este contexto, fue posible proponer un papel para la enzima NR (y la generación de NO asociada) en la activación de estas respuestas de aclimatación a la restricción de P, aportando nuevas líneas de evidencia que conectan el metabolismo del N y el P. Así, este trabajo de Tesis agrega nueva información sobre los posibles eventos de señalización temprana que desencadenan estas respuestas de aclimatación claves bajo una condición de nutrición subóptima de P, indicando posibles eventos de señalización a larga distancia durante las primeras horas de restricción del nutriente. Resultados preliminares, en coincidencia con estudios previos de nuestro laboratorio y de otros autores, parecen sugerir un rol para el NO en los procesos de acidificación de la rizósfera y extrusión de AO. Futuros estudios permitirán avanzar en ese sentido. El análisis de los datos de proteómica en HU de soja luego de 24 h de restricción de P, informados previamente por nuestro laboratorio (Ramos-Artuso et al., 2019. https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2019.01.002) y analizados nuevamente mediante una búsqueda de secuencias de Glycine max descargadas hasta el momento en UniProt (Capítulo V), en conjunción con los resultados mostrados en este trabajo de Tesis, indican la presencia exclusiva o con una abundancia relativa mayor de ciertas proteínas vinculadas a caminos metabólicos tendientes a economizar (glucólisis alternativa) o movilizar (actividad AP) el P, la síntesis y transporte de AO, la generación de NO y ABA, procesos de fosforilación/desfosforilación vinculados a vías de señalización potencialmente asociados a hormonas como el ABA. Este trabajo de Tesis integra nueva información sobre eventos de señalización temprana que desencadenan respuestas típicas de aclimatación claves bajo una nutrición de P subóptima en plantas de soja. Se sugiere un rol para el ABA en eventos tempranos de señalización que involucran la generación de NO en parte aérea en plantas de soja y Arabidopsis durante la restricción de P, abriendo nuevas hipótesis en torno a su posible vinculación con la actividad NR como fuente de generación de esta especie. Futuros estudios permitirán avanzar en este sentido. El conocimiento de los mecanismos de señalización precisos que regulan estos eventos claves podría facilitar el desarrollo futuro de estrategias biotecnológicas que conduzcan a mejorar la homeostasis del P en las plantas de interés agronómico como la soja.