Empleo de anuros autóctonos como herramienta bioanalítica de respuesta temprana a la exposición de herbicidas utilizados en agroecosistemas pampeanos - Pérez Iglesias, Juan Manuel (2018)
El objetivo del presente trabajo de Tesis Doctoral fue evaluar efectos a nivel bioquímico y citogenético inducidos por un nuevo herbicida imazetapir (IMZT) en larvas y adultos de anuros autóctonos, Boana pulchella y Leptodactylus latinasus, asociados a efectos histológicos e individuales, para su posterior incorporación como herramienta bioanalítica de respuesta temprana en programas de monitoreo y diagnóstico ambiental. EL uso intensivo de plaguicidas del modelo agrícola actual es una preocupación para la salud humana y además es propuesto como uno de los factores responsables de la pérdida mundial de la biodiversidad. En particular, las plagas han desarrollado tolerancia a estos agroquímicos y en consecuencia se ha llevado a cabo el desarrollo y la aplicación de nuevos herbicidas. En este contexto, se han desarrollado y comercializado nuevos cultivos tolerantes a herbicidas como sucede en el caso de los cultivos resistentes a imidazolinonas del sistema de producción Clearfield®. IMZT es un herbicida selectivo post-emergente con acción residual miembro de las imidazolinonas utilizado para el control de gramíneas y malezas de hoja ancha en una amplia variedad de cultivos pampeanos. Actualmente, este herbicida ha sido clasificado como compuesto levemente tóxico (Clase III) según la USEPA y la información actual sobre sus efectos ecotoxicológicos en organismos acuáticos es escasa. Por otro lado, la aplicación de herbicidas ha sido propuesta como una de las principales causas influyentes para la disminución de anfibios a nivel mundial. En este sentido, los ecotoxicológicos han buscado diferentes herramientas como los biomarcadores que permitan detectar daños antes que éstos sean irreversibles en los organismos expuestos a plaguicidas. Se conoce que el uso de biomarcadores a nivel citogenético permite detectar respuestas tempranas en anfibios expuestos a concentraciones ambientalmente relevantes de herbicidas. En ese contexto, estos biomarcadores no sólo son recomendados para evaluar la salud de las poblaciones de anfibios sino que además son aceptados como indicadores de la calidad ambiental. Actualmente, existe un consenso en ecotoxicología sobre la necesidad de utilizar biomarcadores específicos a diferentes niveles de organización biológica y generar nuevos biomarcadores con el fin de resolver problemáticas ambientales actuales utilizando especies claves y representativas de ecosistemas perturbados. Con el fin de evaluar la toxicidad del herbicida IMZT y poner a prueba distintos puntos finales en larvas y adultos de B. pulchella y L. latinasus, se llevaron a cabo diferentes tipos de bioensayos utilizando el formulado comercial Pivot® H (10,59 g/l de IMZT) en condiciones controladas de laboratorio (según protocolos estandarizados y propuestos para especies locales) que consistieron en exponer de forma aguda tanto a larvas en diferentes estadios como adultos a posibles escenarios de riesgo para evaluar la respuesta temprana de todos los puntos finales y la potencialidad de IMZT como herbicida emergente, además se llevaron a cabo exposiciones crónicas en larvas de B. pulchella estadio 25 (Gosner) para evaluar la utilidad de los biomarcadores citogenéticos como herramientas de detección temprana, exposiciones para evaluar la capacidad de resiliencia de larvas de B. pulchella estadio 36 (Gosner) luego de una exposición aguda y exposición aguda in vivo y ex vivo para evaluar el tipo de daño que el herbicida induce en el ADN mediante técnicas citogenéticas específicas como el ensayo cometa modificado. Específicamente, se investigaron los efectos letales y subletales ejercidos por el herbicida imazetapir. Para evaluar los efectos letales se calcularon parámetros toxicológicos correspondientes a los valores de la CL50, las curvas de concentración respuesta y los valores LOEC-NOEC. En el caso de los efectos subletales se emplearon puntos finales a diferentes niveles de organización biológica tales como nivel citogenético (micronúcleos – MNs –, anormalidades nucleares y ensayo cometa – EC –), bioquímico (enzimas de estrés oxidativo – CAT y GST – y del sistema colinérgico – AChE –), histológico (histopatología y melanomacrófagos – MMC –) e individual (comportamiento, desarrollo, crecimiento y anormalidades morfológicas). Las respuestas de los puntos finales a IMZT fueron analizados por medio de estadística probabilística utilizando t-test, ANOVA de una vía con test a posterior de Dunnett y ANOVA dos vías, según correspondiera. Con el fin de correlacionar e integrar la respuesta de los biomarcadores en cada especie estudiada se realizaron análisis estadísticos multivariados descriptivos que ayudan a comprender de mejor manera el modo de acción del herbicida en diferentes escenarios de exposición tanto en larvas como en adultos de ambas especies. Finalmente, se obtuvo la curva de sensibilidad de especies y se realizaron estimaciones de sensibilidad entre las diferentes especies pampeanas a IMZT con el objetivo de tener una mejor conocimiento sobre la toxicidad del herbicida en anuros locales. Los resultados de la exposición aguda demostraron que IMZT produce efectos letales con valores de CL5096h = 1,48 mg/l de IMZT para larvas de B. pulchella en ambos estadios de desarrollo y valores de CL5096h = 1,01 y 0,29 mg/l de IMZT para larvas de L. latinasus en estadios de desarrollo 25 y 36 (Gosner), respectivamente. Sumado a esto, se evidenció que otras 7 especies pampeanas en estadio 25 (Gosner) presentan valores de CL5096h entre 0,50 y 1,16 mg/l y esto permitió estimar un valor de concentración peligrosa para especies pampeanas equivalente a 0,53 mg/l de IMZT. Los resultados de los efectos subletales en larvas y adultos de los bioensayos demostraron que todos los biomarcadores utilizados mostraron respuestas por la exposición a IMZT. En particular, para ambas especies en larvas y adultos se evidenciaron efectos cito-genotóxicos por la exposición aguda a IMZT en escenarios reales de concentraciones subletales y dichos efectos fueron detectados por el aumento en la frecuencia de MNs y anormalidades nucleares en eritrocitos y aumentos en la frecuencia del daño en el ADN evidenciada en los nucleoides de células sanguíneas. Por otro lado, se constató que las técnicas citogenéticas aplicadas son útiles para ensayos crónicos ya que responden a bajos tiempos de exposición al herbicida y dichos efectos se detectan antes que se produzcan efectos más severos a nivel individual tal como el retraso en la metamorfosis que se produce a 0,19 mg/l de IMZT. Sumado a esto, a partir de los bioensayos de recuperación se observaron que los daños citogenéticos observados en larvas de B. pulchella a una concentración subletal de 0,39 mg/l de IMZT retornan a niveles basales de valores de daño genético iguales al grupo control luego de 7 días en agua sin herbicida aunque persistan los efectos a nivel individual tales como anormalidades morfológicas y retraso en el estadio de desarrollo. Por último, con los bioensayos citogenéticos para evaluar el tipo de daño en el ADN que produce el herbicida, se detectó que IMZT a concentraciones subletales induce daños oxidativo en bases púricas de larvas de B. pulchella. Además de esto, se constató que IMZT induce alteraciones en el sistema enzimático antioxidante de larvas y adultos de ambas especies. En particular, se observó que IMZT altera significativamente la actividad CAT, GST y AChE en larvas y adultos de B. pulchella a diferentes tiempos de exposición evaluados; mientras que en L. latinasus se observó que sólo GST sufre alteraciones por la exposición a IMZT en larvas pero en adultos se ven afectadas CAT, GST y AChE en diferentes tiempos de exposición evaluados. Los análisis histológicos revelaron aumentos en la frecuencia de MMC por área de hígado en larvas de B. pulchella luego de la exposición aguda a IMZT en un intervalo de concentraciones entre 0,40 y 1,22 mg/l y además se observó la presencia de hígados hipervascularizados en larvas de esta especie expuestas a elevadas de concentraciones de IMZT que variaban entre 1,36 y 1,49 mg/l. Sumado a esto, en adultos de L. latinasus, los resultados demostraron que en diferentes tiempos de evaluación el herbicida IMZT es capaz de inducir alteraciones en el área ocupada por los pigmentos melanina, hemosiderina y lipofuscina de los MMC hepáticos así como también es capaz de provocar lesiones en el hígado tales como hipervascularización y aumentos de los sinusoides hepáticos cuando estas ranas son expuestas a IMZT en posibles escenarios reales de exposición. Finalmente, los estudios de las evaluaciones subletales de los puntos finales demostraron que en altas concentraciones IMZT produce efectos a nivel individual relacionadas a la pérdida de queratodontes en larvas de ambas especies y anomalías en el cuerpo de larvas de L. latinasus, a su vez produce alteraciones en el comportamiento natatorio de ambas especies para tiempos cortos de exposición y efectos en la condición corporal de adultos de ambas especies por disminución del índice de condición corporal en B. pulchella y disminución del índice hepatosomático en L. latinasus cuando ambas especies son expuestas a probables escenarios reales. El análisis multivariado descriptivo permitió corroborar que los biomarcadores evaluados en un mismo nivel de organización biológica están altamente correlacionados y a su vez demostró que existe una progresión de efectos menos severos (detectados a niveles citogenéticos-bioquímicos) a más severos (detectados a niveles histológicos-individuales) conforme aumenta la concentración de IMZT. Los resultados obtenidos de la presente Tesis Doctoral representan una evidencia concreta de que IMZT produce efectos letales y subletales a diferentes niveles de organización en larvas y adultos de especies pampeanas. Además demuestran que el herbicida es un agente oxidativo con capacidad genotóxica, citotóxica y hepatotóxica para anuros y debería ser clasificado según los valores de CL5096h como compuesto tóxico (Categoría II) a muy tóxico (Categoría I), al menos para las especies de anuro pampeanas. Además, se considera que las especies son buenos modelos no sólo para estudios ecotoxicológicos sino también como potenciales bioindicadoras para estudios en ambientes perturbados. Finalmente, se destaca de manera particular que los biomarcadores bioquímicos y citogenéticos empleados en este trabajo a diferentes niveles de organización y de manera integral pueden ser considerados como herramientas válidas de alerta temprana que permitan realizar predicciones sobre efecto letales y subletales irreversibles en futuros estudios ecotoxicológicos así como también en programas de evaluación y monitoreo ambiental en sitios perturbados o con eventos de contaminación