Generación de recombinantes del virus de la poliedrosis nuclear de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) - McCarthy, Christina Beryl (2005)
Los baculovirus sólo infectan artrópodos, en su mayoría, insectos del Orden Lepidoptera. Se caracterizan por producir dos fenotipos diferentes a lo largo del ciclo de infección: viriones brotantes y viriones incluidos en una matriz proteica (o cuerpos de oclusión). Estos últimos, que son de formas poliédricas y se acumulan en el núcleo de las células, dando lugar al nombre que identifica al género Nucleopolyhedrovirus de la familia Baculoviridae. Los baculovirus son insecticidas altamente específicos que no presentan toxicidad para organismos no blanco (Granados y Federici, 1986). Sin embargo, su aplicación como pesticidas microbianos no ha alcanzado su potencial en el control de plagas, con la excepción del virus de la poliedrosis nuclear del defoliador de la soja, Anticarsia gemmatalis MNPV (AgMNPV), que es aplicado sobre más de un millón de hectáreas en Brasil. Algunos de los problemas que han limitado el uso más extendido de los baculovirus incluyen su rango de hospedadores estrecho, tiempo letal medio extendido, dificultades técnicas y económicas en la producción comercial en cultivo celular, régimen de aplicación basado en monitoreos frecuentes, eficiencia a campo variable debido a condiciones climáticas, y actitud de los productores frente al control de plagas, que basado tradicionalmente en la aplicación de insecticidas químicos de rápida acción (Moscardi, 1999). Una de las maneras de realizar investigación básica y aplicada de estos virus involucra la modificación de sus genomas. El método convencional para modificar los genomas de los baculovirus utiliza la recombinación homóloga. Para ello, se construye un plásmido de transferencia que lleva la modificación deseada flanqueada por las secuencias virales del sitio blanco. La cotransfección de las células de insecto con el plásmido de transferencia y el DNA viral, genera virus recombinantes que han adquirido la modificación a través de la recombinación homóloga. Sin embargo, la proporción de recombinantes en la progenie viral es baja (1 a 0.1%) (Smith et al., 1983; Martens et al., 1995). Más aún, la mayoría de los recombinantes son simples recombinantes que incluyen la totalidad del plásmido de transferencia, integrado al genoma viral (O´Reilly et al., 1992). Una manera excelente de vencer estos problemas es usar DNA viral linealizado en el sitio blanco antes de la transfección (Kitts et al., 1990). Este tratamiento disminuye drásticamente la proporción de virus parental (sólo el DNA circular es infectivo) y de simples recombinantes en la progenie viral obtenida luego de la cotransfección. Uno de los métodos más utilizados para linealizar los DNAs de los baculovirus, consiste en introducir sitios de restricción únicos en la región de interés del genoma viral. El DNA viral recombinante puede entonces ser linealizado por digestión con la enzima correspondiente. La presencia de múltiples sitios “únicos” de restricción incrementa la eficiencia de producción de recombinantes (Kitts y Possee, 1993; Martens et al., 1995; Yang y Miller, 1998), probablemente porque es menos probable encontrar moléculas no digeridas, al menos una vez, cuando existen más de un sitio de corte. En este plan de investigación nos propusimos crear un sistema de recombinación homóloga eficiente con el fin de evaluar la posibilidad de incrementar la eficiencia de AgMNPV mediante cambios dirigidos en el genoma sin incluir genes de toxinas. Como paso previo, para aumentar la eficiencia en la recuperación de recombinantes, se incorporaron sitios de restricción únicos en el genoma de AgMNPV, mediante el uso de un esquema de mutagénesis dirigida, utilizando un vector de transferencia de primera generación (pAg-IPpoI). Así se logró optimizar la frecuencia de generación de virus recombinantes. Para el diseño del vector de transferencia de segunda generación (pIERUPOD), entre otros, se tuvo en cuenta la perspectiva ecológica en cuanto al impacto ambiental de un organismo modificado genéticamente. En este sentido, se eligieron genes heterólogos que fueran lo más inofensivos posibles para el medio, no sólo en cuanto a su acción sobre posibles organismos no blanco, sino también en caso de una eventual transferencia lateral de material genético. Las secuencias foráneas elegidas fueron las del gen enhancin 1 de LdMNPV (E1), las del gen DsRed1 de Discosoma, las del sitio interno de entrada del ribosoma (internal ribosome entry site o IRES) del virus de la encéfalo miocarditis (ECMV) y las señales de poliadenilación de SV40. El IRES de ECMV permite la traducción de dos ORFs consecutivos a partir del mismo RNA mensajero (Rees et al., 1996; Jang et al., 1990) y las señales de poliadenilación de SV40 dirigen un correcto procesamiento del extremo 3´ del mRNA. Los enhancins son proteínas que fueron encontradas inicialmente en los cuerpos de oclusión de los GV, y se observó que tienen la habilidad de intensificar la infectividad de algunos NPVs. También se los ha denominado factores sinérgicos o de intensificación viral (viral enhancing factors o vef). Se han propuesto dos funciones para los enhancins, incremento de los eventos de fusión entre el virus y las células hospedadoras y rotura o desorganización de la membrana peritrófica. Lymantria dispar MNPV es un baculovirus patogénico para L. dispar. Debido a que el genoma de LdMNPV es significativamente más grande que el de la mayoría de los baculovirus, contiene varios marcos de lectura abiertos propios (ORFs) como también algunos que presentan homología con los ORFs de GVs. El primer homólogo de GV que se encontró en LdMNPV fue el gen enhancin 1 (E1), y éste fue también el primer enhancin que se encontró en NPVs (Bischoff y Slavicek, 1997). El enhancin de LdMNPV afecta la potencia viral ya que ya que la proteína por sí sola es capaz de incrementar aproximadamente 10 veces la potencia viral (relativo a virus que no presentan genes enhancin) (Popham et al., 2001). Por todas las características mencionadas anteriormente (su capacidad de incrementar la potencia viral y el hecho de que se trata de un enhancin identificado en un NPV) decidimos utilizar el E1 de LdMNPV en nuestra construcción. Por otra parte, la proteína verde fluorescente (GFP) se ha convertido en una herramienta invalorable en estudios biológicos básicos y aplicados (Sullivan y Kay, 1999). Las mutagénesis en el gen salvaje generaron diferentes variantes mejoradas tales como la GFP intensificada (EGFP) (Heim et al., 1995; Cormack et al., 1996) y variantes de colores tales como las proteínas fluorescentes cian (CFP) y amarilla (YFP) (Heim y Tsien, 1996; Miyawaki et al., 1997). Recientemente se describió una familia de proteínas fluorescentes relacionadas con la GFP. La más útil de estas proteínas nuevas es la DsRed, derivada del coral Discosoma. DsRed tiene una fluorescencia naranja-roja con un máximo de emisión a 583 nm. Decidimos utilizar DsRed1 en lugar de GFP, porque consideramos que la posibilidad de excitarlo con luz de longitud de onda de 558 nm representa una ventaja insuperable a la hora de trabajar con sistemas biológicos, en contraposición con el uso de luz UV que resulta perjudicial para los mismos, e imprescindible cuando se trabaja con GFP. Para la construcción del vector de transferencia de segunda generación (pIERUPOD), se eligió la estrategia Splice Overlap Extension PCR (SOE PCR). Ésta consistió en la amplificación independiente de pares de fragmentos con cebadores diseñados de manera tal de agregarle secuencias del otro fragmento. En una posterior amplificación se utilizaba como molde una mezcla de ambos fragmentos para levantar a ambos fragmentos en uno solo; en esta amplificación, las secuencias del otro fragmento que poseía cada producto de amplificación, servían para que las hebras de ssDNA se unieran en los extremos internos, quedando así el molde final para la amplificación de ambos fragmentos en uno. Una vez finalizada la construcción de este vector, se procedió a la generación de los recombinantes correspondientes. Sin embargo, como éstos no tenían la estructura genómica buscada, se construyeron versiones alternativas del plásmido de transferencia de segunda generación (pIERUPOD-p10, pEUPOD y pRUPOD), buscando solucionar esta problemática. En el primer caso (pIERUPOD-p10), se cambió uno de los promotores de poliedrina por el de p10, otro promotor muy tardío. En los otros dos casos (pEUPOD y pRUPOD), se eliminaron algunas secuencias del vector. En el caso de pEUPOD, se quitaron las secuencias IRES y del gen DsRed1. En el caso de pRUPOD, se eliminaron las secuencias IRES y del gen E1. A pesar de estos intentos, la generación de virus recombinantes a partir de cada versión alternativa resultó aberrante. Sin embargo, se divisaban patrones conservados en las diferentes especies recombinantes obtenidas a lo largo de la segunda parte de este trabajo de tesis. Diversos ensayos realizados sobre todas estas especies recombinantes, que incluyeron hibridaciones con un juego de sondas, confirmaron estos patrones y permitieron clasificarlos en dos grupos, denominados I y II, en base a las similitudes observadas. En el grupo I se dedujo que hubo inserciones y/o duplicaciones, mientras que en el grupo II se dedujo la presencia de deleciones. Estos resultados, al igual que los datos aportados por Wu et al. (1999), sugieren que el mecanismo de replicación del DNA de los baculovirus podría ser promiscuo en cuanto a la elección de molde y/o a la elección del partner de recombinación. Wu et al. (1999) explican la existencia de baculovirus recombinantes inestables que no pueden ser aislados por placa (Lu et al., 1996), debido a la replicación e integración del DNA cotransfectado al genoma viral. Estos resultados también son relevantes en cuanto a la seguridad en el uso de baculovirus modificados genéticamente como biopesticidas o como vectores en terapia génica. Finalmente, los resultados obtenidos hasta el momento no descartan la posibilidad de lograr AgMNPVs recombinantes en futuros experimentos. Para ello, deberán diseñarse los vectores de transferencia en base al conocimiento de la secuencia nucleotídica del genoma viral completo y eliminando todas las secuencias cortas con cierta homología para evitar que ocurran reorganizaciones del DNA por recombinación intramolecular.