Estudio de peptidasas aspárticas de flores de Asteraceae con potencial aplicación biotecnológica - Colombo, María Laura (2016)
Los genomas de plantas codifican cientos de peptidasas lo que representa decenas de familias no relacionadas entre sí de estas enzimas, que cumplen en las plantas un sinfín de funciones. Sus roles no se restringen a formar parte del aparato degradativo, removiendo proteínas no deseadas, mal plegadas o dañadas, sino que también actúan como componentes esenciales en la activación y maduración de proteínas clave a través de clivajes proteolíticos específicos. Además, las proteasas pueden asegurar tanto la rotación de enzimas que limitan la velocidad como la estequiometría de complejos proteicos así como la degradación tanto de proteínas dañadas como de almacenamiento de tal modo que aseguran el correcto funcionamiento celular. En la última década, las peptidasas de plantas han sido sujeto de intensa investigación y se han propuesto como parte de varios e importantes procesos entre ellos defensa de la planta contra patógenos y muerte celular programada. Esta diversidad funcional se correlaciona con los datos moleculares: las peptidasas se expresan específicamente en tiempo y espacio y se acumulan en diferentes compartimentos subcelulares. Las proteinasas aspárticas (PAs) (E.C.3.4.23) constituyen una de las cuatro clases principales de endoproteasas, siendo las otras tres serínicas, cisteínicas y metaloproteinasas. Las PAs comparten muchas características en términos de secuencia, estructura tridimensional y mecanismo catalítico. Aún es poco lo que se sabe acerca de sus funciones biológicas y para la gran mayoría estas funciones son solamente hipotéticas. Se ha implicado a las PAs de plantas en la regulación de procesos biológicos, tales como el reconocimiento de patógenos y pestes, la muerte celular programada y la inducción efectiva de la respuesta de defensa. Las PAs de plantas se expresan como precursores parcialmente inactivos. Estos zimógenos se caracterizan por la presencia de una secuencia señal hidrofóbica N-terminal, responsable de la translocación al retículo endoplasmático, seguido por un prosegmento de alrededor de 40 aminoácidos, y un dominio N-terminal y otro dominio C-terminal separados por una inserción que comprende aproximadamente 100 aminoácidos, denominada inserto específico de planta (PSI). Las PAs de plantas han sido purificadas y caracterizadas a partir de numerosas especies de gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas y han sido implicadas en procesos de respuesta celular por estrés biótico y abiótico, han sido empleadas como herramientas en distintos procesos, en la fermentación y manufactura de una variedad de productos, incluyendo producción de quesos, péptidos bioactivos, nutracéuticos y formación del sabor. Las PAs de papa (Solanaceae) han manifestado actividad citotóxica contra patógenos de planta, espermatozoides y células de leucemia humana, Cardosina A, una de las PAs de flores de Cynara cardunculus (Asteraceae) forma un complejo con fosfolipasa Dα por lo que han sido sugeridas posibles acciones concertadas y sinérgicas en procesos degenerativos como los que se observan durante la respuesta al estrés, la senescencia de la planta y/o la interacción pistilo-polen. Además se ha propuesto que cardosina A, por ser una proteasa de vacuola tendría un rol importante en el colapso vacuolar durante la muerte celular. En el genoma de Arabidopsis fueron identificados 50 genes que codifican para PAs del tipo de la pepsina, que luego se asignaron a tres categorías diferentes: PAs típicas, tipo nucelina, y atípicas Las PAs de plantas más estudiadas son: fitepsina de semillas de cebada (Hordeum vulgare, familia Poaceae) peptidasas de papa (Solanum tuberosum, familia Solanaceae) y cardosinas de flores del cardo de Castilla (Cynara cardunculus, familia Asteraceae). Se ha demostrado la formación de un complejo entre cardosina A y fosfolipasa Dα lo que sugiere posibles acciones concertadas y sinérgicas en procesos degenerativos como los que se observan durante la respuesta al estrés, la senescencia de la planta y/o la interacción pistilo-polen. Se ha propuesto que cardosina A, por ser una proteasa de vacuola tendría un rol importante en el colapso vacuolar durante la muerte celular. Por su parte las PAs de papa han manifestado actividad citotóxica contra hongos patógenos de planta En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado las peptidasas aspárticas presentes en extractos ácidos de flores Silybum marianum que pertenece a la familia Asteraceae. Se clonaron los precursores de las aspartilproteasas (preproenzimas) a partir del ARNm de flores de S. marianum. Se predijeron las propiedades fisicoquímicas. Se realizó un estudio comparativo con los precursores de otras peptidasas aspárticas conocidas y se predijó la estructura molecular de las peptidasas clonadas por modelado por homología a partir de la secuencia aminoacídica y en base al modelo estructural a partir del cual se realizó la predicción funcional, motivos estructurales y funcionales en las peptidasas clonadas y se generó un modelo tridimensional de las peptidasas clonadas. Por otro lado se estudió la localización subcelular de las peptidasas y sus mutantes fusionados a proteínas fluorescentes por expresión transiente en Nicotiana benthamiana y microscopía confocal.