Caracterización de plásmidos de Acinetobacter spp. de origen hospitalario y ambiental - Salto, Ileana Paula (2017)
Los plásmidos pueden ser considerados como un ensamble de distintos módulos funcionales característicos que le confieren su identidad (Thomas, 2000). Los plásmidos pueden contener en su secuencia genes de proteínas con funciones plenamente plasmídicas (replicación, movilización y mantenimiento), como así también módulos accesorios que le confieren al microorganismo huésped alguna función beneficiosa para competir por un nicho ecológico. Estos plásmidos, cumplen una función particular y necesaria para la supervivencia del organismo bajo distintas condiciones de estrés. En este marco, se han descripto numerosos genes accesorios, que incluyen determinantes de patogenicidad y virulencia, operones de degradación de compuestos xenobióticos, determinantes de simbiosis, y resistencia a antimicrobianos, entre otros. El fenotipo de multiresistencia a antimicrobianos ha tenido un impacto muy grande en las últimas décadas, debido a la presencia de estos genes en bacterias intrahospitalarias (Zavascki et al., 2007, Jean & Hsueh, 2011, Magiorakos et al., 2012). Cuando esta información alcanza a los elementos móviles como los plásmidos, la dispersión de esta información dentro de la comunidad bacteriana cobra lugar rápidamente, dando a lugar a epidemias de bacterias multiresistentes (Woodford et al., 2011, Halachev et al., 2014, Verroken et al., 2014, Eldholm et al., 2015). Debido a la capacidad de los plásmidos de movilizarse, replicarse y mantenerse autónomamente, como así también de adquirir nueva información genética, se han convertido en vehículos especializados en la transmisión de dicha información y por lo tanto en un blanco importante de estudio para diseñar estrategias de control de la diseminación de resistencia a antimicrobianos (Tabone et al., 2014, Getino et al., 2016). Las bacterias pertenecientes al género Acinetobacter han cobrado en los últimos años relevancia clínica, debido a la aparición frecuente de cepas multi/pan resistentes asociadas a infecciones hospitalarias (Villegas & Hartstein, 2003, Scott et al., 2007, Zarrilli et al., 2013, Halachev et al., 2014). Este fenotipo de resistencia ha sido asociado a la adquisición de información por transferencia horizontal de genes, en donde los plásmidos son protagonistas principales. El estudio de la biología de estos replicones puede proporcionar nueva evidencia molecular que ayude a comprender el peso de la transferencia horizontal de plásmidos en la dinámica de transferencia de ADN en general y de resistencia en particular, como así también en la adaptación de estas bacterias a los distintos nichos ecológicos que ocupa. En este trabajo, se evaluó la presencia de plásmidos en dos colecciones de bacterias pertenecientes al género Acinetobacter de origen hospitalario o ambiental. Los perfiles en geles de lisis in situ, demostraron que la mayoría de los aislamientos eran portadores de al menos un replicón plasmídico y que la distribución tanto en tamaño como en cantidad de plásmidos fue variada entre los aislamientos. A partir de aquellos aislamientos portadores de plásmidos, se realizó el aislamiento plasmídico en gran escala y las muestras fueron purificadas por ultracentrifugación en gradiente isopícnico de CsCl-bromuro de etidio. Las muestras enriquecidas en plásmidos fueron secuenciada utilizando la plataforma MiSeq de Illumina. El análisis in silico de los replicones secuenciados completos mostró que la mayoría de los plásmidos presentaron similitud de secuencia con otros plásmidos aislados de cepas de Acinetobacter spp. y que algunos tenían secuencias homólogas a plásmidos aislados de otros géneros bacterianos. Muchos replicones mostraron no sólo tener identidad sino que también presentaron sintenía con plásmidos presentes en base de datos. Sin embargo, en muchos casos la sintenía no fue completa. La presencia de módulos de replicación adicionales, como así también la ausencia de módulos accesorios, como por ejemplo de resistencia, podrían indicar que los replicones tienen un ancestro en común, el cual, pudo haber incorporado o perdido información a lo largo de su evolución. Estos cambios en la estructura, le pudieron haber conferido al replicón la capacidad de poder dispersarse y mantenerse en bacterias de distinto género y/o especie. Con respecto a los módulos de replicación, un análisis que incluyó a todas las Reps de plásmidos de Acinetobacter spp. en base de datos determinó que las proteínas con dominio Rep_3 son las más frecuentemente encontradas en plásmidos de bacterias de este género y esto fue congruente con lo hallado en las colecciones plasmídicas. Para determinar la cercanía entre estas proteínas se llevó a cabo un estudio filogenético de las proteínas completas utilizando el mejor modelo de evolución encontrado para estas secuencias. El árbol resultante graficó la relación filogenética entre estas proteínas y determinó que existen 16 grupos bien diferenciados y soportados. Las secuencias de proteínas Rep_3 fueron utilizadas para buscar homólogos en base de datos y los resultados indicaron que proteínas muy emparentadas se encontraron no sólo en bacterias del género Acinetobacter, sino también en otros géneros distantes. Esta información permite predecir el rango de huésped en donde estas proteínas podrían potencialmente ser funcionales y consecuentemente permitir la replicación y permanencia de los plásmidos. A partir de la búsqueda de proteínas involucradas en mantenimiento plasmídico se pudieron identificar proteínas involucradas en al menos dos mecanismos bien conocidos: partición activa y muerte post-segregacional. Estas proteínas encontraron sus homólogos más cercanos tanto en enterobacterias como en distintas especies del género Acinetobacter. El análisis bioinformático de las secuencias plasmídicas también permitió reconocer proteínas pertenecientes a los sistemas del Dtr y Mpf involucrados en el proceso de conjugación. El análisis filogenético de las relaxasas permitió clasificar a los plásmidos dentro de distintas familias, descriptas en trabajos anteriores (Francia et al., 2004, Garcillan-Barcia et al., 2009). Algunas de las relaxasas estudiadas se encontraron formando un subclado robusto y bien definido dentro de la gran familia MOBQ. El análisis de las secuencias de las relaxasas de este subclado permitió identificar características específicas-únicas de estas proteínas dentro de los 3 motivos que forman parte del dominio funcional N-ter. Debido a esto, este nuevo subclado fue nombrado como el nuevo subgrupo MOBQ4. El análisis experimental de los Dtr de los plásmidos de esta colección pertenecientes al subgrupo MOBQ4, reveló que todos fueron funcionales. Sin embargo, presentaron diferencias en las frecuencias de conjugación cuando un mismo Dtr se enfrentó a distintos plásmidos conjugativos, como así también, cuando distintos Dtr se enfrentaron a un mismo plásmido con funciones helper. Este comportamiento diferencial indicó que, en primer lugar, los sistemas del Mpf de los plásmidos conjugativos reconocen diferencialmente a un mismo relaxosoma. Por otra parte, la diferencia en la frecuencia de movilización de plásmidos con distintos Dtr enfrentados a un mismo plásmido helper demuestra que existen diferencias en el reconocimiento de un mismo Mpf por los relaxosomas. El alineamiento de las proteínas relaxasas completas demostró que las proteínas difirieron en su extremo C-ter y que esta podría haber sido la razón de las diferencias encontradas, si este segmento tuviese relevancia en el reconocimiento y/o transporte llevado a cabo por el Mpf. El análisis filogenético de las proteínas relaxasas en general fue congruente con lo hallado en el análisis nucleotídico de los esqueletos plásmídicos de estos replicones, sin embargo, el análisis funcional para miembros de un mismo grupo demostró que el método para la clasificación de plásmidos no es suficiente para explicar el comportamiento de estos últimos en la transferencia por conjugación en presencia de distintos plásmidos conjugativos. Los resultados mostrados en este trabajo de Tesis en conjunto demuestran que los plásmidos de Acinetobacter spp. han evolucionado para convertirse en vectores especializados en la transferencia de la información. Se pudo demostrar que existen estructuras modulares eficientes y muy conservadas que son responsables de la herencia estable y propagación de los plásmidos como entidades independientes y que la información accesoria se encuentra en dinámica constante, pudiendo ser adquirida dentro de estas estructuras especializadas para luego transferirse horizontalmente. El estudio realizado en este trabajo de Tesis sobre los módulos plasmídicos de bacterias del género Acinetobacter se espera contribuya al aumento de la información sobre la biología de estos vectores, abriendo camino a la comprensión de la dinámica evolutiva de Acinetobacter hacia su establecimiento como un patógeno nosocomial. Así también, se espera que aporte conocimiento a la biología de los plásmidos en general como entidades independientes especializadas en la propagación de la información.