Clonado y expresión de la toxina Épsilon en Pichia pastoris como alternativa para la prevención de la exterotoxemia - Manfredi, Mauro Joaquin (2024)
El género Clostridium spp., se caracteriza por ser el mayor productor de toxinas entre los distintos géneros de bacterias. Entre las especies se describen las tres toxinas más potentes, que incluyen la neurotoxina tetánica (TeNT) y la neurotoxina botulínica (BoNT), producidas respectivamente por Clostridium tetani y Clostridium botulinum y la toxina épsilon (ETX) de Clostridium perfringens. C. perfringens es un bacilo grampositivo, anaerobio, que forma esporas resistentes al calor, capaz de producir hasta 30 potenciales toxinas que constituyen gran parte de su virulencia. Se han descripto 6 exotoxinas principales, también denominadas "toxinas mayores": toxina alfa (CPA), toxina beta (CPB), toxina iota (ITX), enterotoxina (CPE - por su sigla en inglés: C. perfringens enterotoxin), toxina similar a la de la enteritis necrótica B (NetB) y toxina épsilon (ETX). ETX es una potente toxina formadora de poros producida por los toxinotipos B y D. Se sintetiza inicialmente en forma de protoxina inactiva y se activa mediante clivaje proteolítico en el intestino, causando enterotoxemia, una enfermedad mortal que afecta principalmente a pequeños rumiantes. Por esta razón, la inmunoprofilaxis es el único método eficaz de prevención para evitar las pérdidas económicas. En la actualidad, las vacunas disponibles formuladas como anavacunas, presentan una cantidad excesiva de componentes no específicos que pueden interferir con la respuesta inmune y aumentar el riesgo de accidentes vacunales. Además, la manipulación del microorganismo y la toxina per se implica un alto riesgo biológico, por lo que su producción recombinante sería una alternativa para su uso como inmunógeno. En este contexto, el sistema de expresión en Pichia pastoris es prometedor por su procesamiento post-traduccional similar al de eucariotas superiores, un promotor inducible por metanol y la capacidad de excretar proteínas al medio extracelular. El objetivo de este trabajo fue obtener y caracterizar la proteína ETX en P. pastoris. Para ello, se desarrollaron dos versiones: una truncada (ETXt) y una mutada (ETXmH106P) que produce una proteína atóxica. Luego de amplificar por PCR el fragmento correspondiente al gen etx, ambas versiones fueron clonadas en el vector pGEMt. Verificada la presencia de los insertos por secuenciación, fueron subclonadas en el vector de expresión pPIC9 y con las construcciones obtenidas se transformó la levadura P. pastoris GS115. Posteriormente, se optimizó la expresión en cultivos a baja y alta escala y se evaluará la capacidad antigénica e inmunogénica, analizando la respuesta inmune en un modelo in vivo e in vitro.