Caracterización funcional del módulo de unión a carbohidratos presente en el gen de expansina 1 (LeExp1) de tomate : Efecto de su sobreexpresión sobre la calidad y el ablandamiento del fruto - Perini, Mauro Alejandro (2017)
En Argentina, el tomate (Solanum lycopersicum) es la quinta hortaliza a nivel de producción, siendo el cinturón hortícola de la ciudad de La Plata uno de los principales productores de tomate fresco para consumo de la Provincia de Buenos Aires. Un aspecto clave para optimizar el aprovechamiento de la producción es mejorar los aspectos ligados a la conservación poscosecha (periodo de almacenamiento del producto previo al consumo en fresco), lo cual requiere de un conocimiento detallado de los procesos metabólicos que ocurren durante la maduración y senescencia. La firmeza, uno de los principales determinantes de la calidad poscosecha y la vida útil de los frutos, está determinada por la resistencia mecánica impuesta por la pared celular. Las expansinas (proteínas sin actividad hidrolítica conocida) están implicadas en el desmantelamiento, no hidrolítico, de las paredes celulares vegetales, particularmente en procesos en los que es necesaria la relajación de la pared, como el desarrollo y la maduración de los frutos. Como muchas proteínas asociadas a carbohidratos, las expansinas tienen un dominio catalítico putativo y un módulo de unión a carbohidratos (CBM). Se cree que el CBM actuaría anclando a la expansina a la superficie de la celulosa, mientras que el dominio catalítico putativo interactuaría con las hemicelulosas en la superficie de las microfibrillas provocando la ruptura de los enlaces no covalentes, principalmente puentes de hidrógeno, existentes entre la celulosa y las hemicelulosas de la matriz. Tomate incluye 38 genes de expansinas pertenecientes a diferentes grupos filogenéticos. Estudios previos han demostrado que existe una expansina específica de fruto, la α-expansina 1 de tomate (SlEXPA1). La determinación de la actividad expansina depende de la medición de la capacidad de extensión de paredes celulares aisladas mediante el uso de extensómetros "ad hoc" poco convencionales, hecho que ha restringido fuertemente su estudio. Esto nos impulsó a adaptar una metodología para medir la extensión de la pared celular y la actividad expansina usando un medidor de textura comercial, equipo común encontrado en laboratorios de ciencia de los alimentos o tecnología poscosecha. Fue posible medir el crecimiento ácido de hipocótilos de pepino y de tomate, así como determinar la actividad expansina sobre extractos de proteínas de hipocótilos de pepino, de frutos frutilla y de frutos de tomate en diferentes estadios de madurez, de manera fiable y reproducible. Por otro lado, haciendo uso de un sistema de expresión heterólogo (Escherichia coli), se sobreexpresaron tanto la proteína completa (SlEXPA1) como sus dominios característicos (CBM-SlEXPA1 y EXP-SlEXPA1), con la finalidad de analizar de manera integral el mecanismo de unión sobre diversos sustratos sintéticos de la pared celular vegetal. Se demostró, a través de ensayos de unión “in vitro”, que tanto la proteína completa como ambos dominios se unen a celulosa microcristalina y xilano de avena. Para el caso de la celulosa la unión es mayor para la proteína completa y el dominio CBM, mientras que para el caso del xilano la unión es mayor para la proteína completa y el dominio catalítico putativo. Asimismo, se demostró que dichas proteínas no poseen afinidad por un sustrato no presente en la pared celular como lo es el almidón. Por último, se sobreexpresó de manera constitutiva el CBM de la expansina 1 de Solanum lycopersicum (CBM-SlEXPA1) en la pared celular de plantas de tomate, siendo ésta la primera vez que un CBM se sobreexpresa en un fruto destinado a controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento del fruto. La sobreexpresión de CBM-SlEXPA1 genera un aumento de la resistencia mecánica de las hojas, un retardo en el proceso de ablandamiento del fruto, una reducción en la susceptibilidad al ataque por Botrytis cinerea y un aumento en su contenido de pared celular; mientras que no modifica el crecimiento de las plantas y el fenotipo general, y no altera los parámetros de calidad característicos del fruto. La presente tesis aborda desde diferentes aproximaciones el estudio de una proteína en particular. Se concluye que, la fácil adaptación metodológica para la determinación de la actividad expansina podría contribuir a facilitar y aumentar el análisis de las propiedades de las expansinas en diferentes sistemas; las α-expansinas, apoyando resultados previos, se unirían a través del dominio CBM a celulosa mientras que el dominio catalítico putativo intervendría en la relajación de la matriz de hemicelulosa con la consecuente relajación de la pared vegetal; la sobreexpresión de un CBM en la pared celular sería una estrategia factible de utilizar para lograr aumentar la vida poscosecha de frutos carnosos, como lo es el tomate, sin alterar el crecimiento de la planta.