Estudios inmunológicos y moleculares de la infección por Toxoplasma gondii en cerdos - Pardini, Lais Luján (2012)
Los objetivos de este trabajo fueron evaluar dos pruebas de ELISA para la detección de anticuerpos en cerdos naturalmente infectados con Toxoplasma gondii, así como también aislar y genotipificar cepas obtenidas a partir de cerdos de Argentina. Una de las pruebas de ELISA fue elaborada con un antígeno nativo TgSAG1 y otra con un antígeno recombinante rGra7. Para la evaluación de ambas pruebas se obtuvieron 602 sueros de cerdos para consumo y para realizar el ELISA-TgSAG1, de ese total se sortearon 300 al azar. Los sueros se analizaron por inmunofluorescencia indirecta (IFI) e immunoblotting (IB) para la detección de anticuerpos para T. gondii. Aquellos que resultaron serológicamente positivos y/o negativos para ambas pruebas, se utilizaron como estándar relativo de comparación (RSC) y se analizaron por los 2 ELISAs. Se determinó la concordancia y se evaluó la sensibilidad (S) y especificidad (E) utilizando la curva de “receiver operator characteristic curve” (ROC). Se detectaron anticuerpos específicos para T. gondii en 160 de 300 sueros (53,3%) por IB, en 133 de 300 (44.3%) por IFI, y en 123 de 300 sueros (41%) por ELISA-TgSAG1 (P30). Ciento once sueros de los 229 usados como RSC fueron seropositivos, y de ellos 103 resultaron positivos por ELISA-TgSAG1. De los 118 negativos para RSC, 116 fueron negativos por ELISA-TgSAG1. La concordancia entre los resultados obtenidos por RSC y ELISA-TgSAG1 fue excelente (ĸ= 0,9124; p ≥ 0,05). El análisis ROC mostró un área bajo la curva (AUC) altamente precisa de 0,983 relativa a las RSC, se obtuvo una S de 92,8% y una E de 98,3%. En una primera etapa al analizarse por ELISA-rGra7 160 sueros (IFI ≥1:25) concordantes por RSC se obtuvo un valor ĸ de de 0,2941 para RSC/ELISA-rGra7 y una S de 87,5% y una E de 55%. En una segunda etapa (IFI ≥1:50) se analizaron los 229/300 sueros concordantes y se detectaron anticuerpos en 135/229 por ELISA-rGra7. Sin embargo 28/111 sueros positivos de los RSC no fueron detectados por esta prueba y por el contrario 52/118 sueros negativos del grupo RSC se identificaron como positivos. El valor de ĸ entre RSC y ELISA-rGra7 fue de 0,3051, siendo la S de 74,7% y la E de 55,9 %. Se tomaron muestras de tejidos, suero y jugo de carne de cerdos (n=122) de frigorífico, y se analizaron por IFI. Se realizó la digestión pépsica de los tejidos de los animales seropositivos seleccionados (33/48) y el producto de la digestión se inoculó en ratones por vía subcutánea. Si bien se detectaron anticuerpos específicos para T. gondii en 5/95 de los ratones inoculados, no se detectaron taquizoítos en el lavado peritoneal ni ADN específico por PCR. Dos aislamientos previos conservados en el laboratorio de Inmunoparasitología denominados PIG10 y PIG15 se analizaron por PCR-RFLP para determinar su genotipo en relación a los marcadores 5′SAG2, 3′SAG2, BTUB, GRA6, SAG3, c22-8, L358, PK1, c29-2 y Apico. El aislamiento denominado PIG10 correspondió al genotipo II para todos los marcadores, mientras que el aislamiento PIG15 presentó alelos tipo II en todos los marcadores con excepción del marcador Apico, para el que correspondió al tipo I. De acuerdo a los resultados obtenidos es posible concluir que la prueba de ELISA-TgSAG1 es muy adecuada para la detección sensible y específica de anticuerpos en cerdos naturalmente infectados. Luego de observar la baja concordancia obtenida para IFI/ ELISA-rGra7, IB /ELISA-rGra7 y con los RSC, se considera que la proteína recombinante rGra7 bajo las condiciones en que fue utilizada en este estudio, no permitiría detectar correctamente animales seropositivos y/o seronegativos. Esto podría relacionarse con la estructura de la proteína recombinante empleada, derivada del modelo de expresión procarionte o a la metodología utilizada para la purificación de la misma. La imposibilidad de aislar T. gondii de los animales muestreados en este estudio, probablemente se deba a que la carga parasitaria presente en los tejidos no fue suficiente para infectar a los ratones inoculados, sin embargo, fue capaz de inducir respuesta inmune. De acuerdo a nuestro conocimiento esta es la primera vez que se realiza la tipificación por PCRRFLP de cepas aisladas de cerdos en nuestro medio.