Extracción y bioconversión del ácido clorogénico de la yerba mate en químicos finos - Butiuk, Ana Paula (2016)
1° Etapa Se analizó el contenido de ácido clorogénico (ACG) en muestras de yerba mate (Ilex paraguariensis) obtenidas de dos plantas de procesamiento ubicadas al Sur de la provincia de Misiones-Argentina, a lo largo de las diferentes etapas de procesamiento y en dos épocas del año. El contenido total de ACG (expresado en base seca) varió desde 4,58 ± 0,04 a 8,08 ± 0,10 g ACG/100 g hojas, y de 3,16 ± 0,06 a 7,89 ± 0,53 g ACG/100 g palos, a lo largo de las diferentes etapas de industrialización. El contenido de ACG decreció a lo largo de las diferentes etapas de industrialización. El análisis cuantitativo-comparativo indicó que el mayor contenido de ACG fue encontrado en las muestras de yerba mate recién cosechada: hoja y palo verde. No hubo diferencias significativas (p < 0,05) en el contenido de ACG entre estas muestras. El contenido de ACG al inicio de la época de zafra fue sustancialmente mayor al obtenido al final de la época de zafra, tanto para las hojas como para los palos verdes. Se evaluó el método de extracción acuosa sólido-líquido más adecuado, para obtener un extracto rico en ACG, a partir de muestras de palo verde de yerba mate (PVYM), material vegetal previamente seleccionado debido a su elevado contenido en ACG. La relación sólido/líquido (S/L) óptima fue de 1:20 (p/v), a mayor relación disminuyó la extracción de ACG debido a la saturación del extracto. El ACG extraído en las dos primeras etapas de extracción representó el 98,5 % del contenido total de ACG de las tres etapas. A partir de la relación S/L óptima se evaluó la cinética de extracción a 80 °C para los dos tamaños de partículas. El tiempo de extracción tuvo influencia significativa únicamente para las partículas de mayor tamaño (1 × 5 mm < tamaño de partícula < 2,5 × 5 mm), mientras que la mayor concentración de ACG (1,05 g ACG/l) fue extraída con partículas de menor tamaño (Ø partícula < 500 µm), siendo en este caso el proceso de extracción prácticamente instantáneo. Se realizó un estudio cinético con las partículas de mayor tamaño, el mismo indicó que la extracción de ACG aumentó con el tiempo de extracción hasta los 30 min para todas las temperaturas evaluadas. Así mismo la extracción de ACG aumentó con la temperatura de extracción hasta los 80 °C; sin embargo, un incremento adicional de la temperatura (100 °C) condujo a una disminución de la extracción. La cinética de extracción acuosa de ACG se ajustó adecuadamente dos modelos matemáticos (R2 > 0,90) y los resultados obtenidos con el diseño de superficie de respuesta indicaron que los valores óptimos para tiempo y temperatura de extracción fueron 25-30 min y 80-90 °C, respectivamente, alcanzando en este caso una concentración de ACG de 0,43 g ACG/l. 2° Etapa Se analizó la producción de la enzima clorogenato hidrolasa (EC 3.1.1.42, CHasa) por varias cepas fúngicas utilizando materiales derivados del procesamiento de la yerba mate como inductores de la actividad enzimática. Todas las cepas fúngicas ensayadas presentaron actividad CHasa. Sin embargo, la CHasa fue altamente inducida en los micelios de Aspergillus niger AKU 3302, observándose las manchas más intensas de ácido cafeico en el TLC con las concomitantes reducciones en ACG, y el valor de actividad más elevado (6,49 UE/ml). Todas las muestras de yerba mate produjeron actividad CHasa, pero el extracto concentrado de yerba mate (EYM) fue seleccionado como el inductor más conveniente. El diseño experimental reveló que la producción óptima de CHasa (≈ 12 UE/ml) se alcanza a largos tiempos de inducción (≥ 25 h) y bajas concentraciones de inductor (0,1-0,2 % p/v, en base seca). Se realizó la producción de CHasa de A. niger AKU 3302 en medio Czapek líquido modificado, a escala frascos agitados (180 rpm) y a 30 °C, al cual se le adicionó un EYM al final de la etapa exponencial de crecimiento. En el extracto enzimático no se detectó actividad polifenoloxidasa. La CHasa presentó mayor actividad a pHs ligeramente neutros y fue estable en un rango de pH entre 2,0 a 9,0 y hasta 50 °C. El diseño experimental reveló que la actividad CHasa óptima se alcanza a una temperatura de 45 °C. Los valores de Km para la CHasa estimados a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk y la gráfica de Eadie-Hofstee fueron de 0,257 y 0,229 g/l, respectivamente. Mientras que los valores de Vmáx obtenidos con cada gráfica fueron de 1,996 y 1,901 µmol/l.min, respectivamente. El coeficiente de temperatura fue de 1,5 y la energía de activación (Ea) de 6,38 kcal/mol. Se demostró la capacidad de la CHasa para hidrolizar el ACG contenido en sustratos naturales como el EYM. Se preparó un micelio no viable de A. niger AKU 3302 con actividad CHasa naturalmente inmovilizada (CHasaNI). La relación óptima entre inactivación térmica del micelio y elevada actividad CHasa fue observada luego de un tratamiento térmico a 55 °C por 60 min, reteniendo bajo estas condiciones cerca del 90 % de la actividad inicial. Se determinaron las condiciones óptimas de operación de la CHasaNI, así como sus parámetros cinéticos y termodinámicos a fin de establecer las condiciones apropiadas para su utilización en la hidrólisis del ACG presente en sustratos naturales. Las condiciones óptimas de operación para la CHasaNI naturalmente fueron: 50 ºC, pH 6,5 y una velocidad de agitación de 100 golpes/min. Los valores de Km para la enzima CHasaNI estimados a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk y la gráfica de Eadie-Hofstee fueron de 0,48 y 0,50 g/l, respectivamente. Mientras que los valores de Vmáx obtenidos con cada gráfica fueron de 4,149 y 4,414 µmol/l.min, respectivamente. CHasaNI fue estable en un rango de pH entre 2,0 – 9,0 y hasta 50 °C durante 8 h. Los cationes que produjeron una disminución de la actividad CHasa fueron Fe+3 y Zn+2. Los resultados obtenidos demuestran la aplicación potencial de los pellets del micelio de A. niger AKU 3302 como un biocatalizador naturalmente inmovilizado con actividad CHasa. Las propiedades y la estabilidad de la enzima exhibieron características interesantes que pueden ser adecuadas para su aplicación futura en la bioconversión del ACG. Además, la alta estabilidad operacional de la CHasa naturalmente inmovilizada propicia su aplicabilidad para la hidrólisis continua de este sustrato presente en extractos naturales. 3° Etapa La obtención de un extracto acuoso con elevado contenido de ACG a partir de los palos de yerba mate (1° Etapa) y la utilización de la CHasaNI como biocatalizador enzimático capaz de hidrolizar el ACG en AC y AQ (2° Etapa), constituyen la fuente y el proceso necesarios para la obtención de los metabolitos de interés, respectivamente. Con el fin de desarrollar una producción más práctica de estos metabolitos, se propuso la utilización de un biorreactor del tipo lecho empaquetado conteniendo la CHasaNI como relleno del biorreactor a través del cual se hizo circular en forma ascendente una solución de PVYM. El ACG inicialmente presente en el extracto de PVYM fue completamente convertido en AC y AQ al circular a través de un biorreactor de lecho empaquetado, alcanzándose rendimientos del 100 % de conversión al trabajar a un caudal de 13,6 ml/h. Se confirmó la eficacia de la CHasaNI como biocatalizador inmovilizado estable con actividad CHasa, y su estabilidad para usos repetidos durante varias veces (~ 12 h) sin pérdida apreciable de la actividad catalítica. Se alcanzaron conversiones de AC y AQ mayores al 100%, lo cual se podría deber a que tanto el AC como el AQ fueron liberados a partir de otros ésteres diferentes al ACG por la acción de otras esterasas intracelulares (además de CHasa). Se confirmó la eficacia de la inactivación térmica del micelio de A. niger AKU 3302 ya que no se observó formación de gas (CO2) por respiración al hacer circular una solución de ACG a través del biorreactor de lecho empaquetado.