Análisis de la formación de complejos insolubles entre polímeros de cadena flexible con carga eléctrica y tripsina : sus potenciales aplicaciones biotecnológicas - Braia, Mauricio Javier (2013)
En la actualidad, la industria se ha convertido en un gran consumidor de enzimas ya que éstas permiten acelerar reacciones, disminuir los costos de producción, mejorar el rendimiento de un proceso industrial y hacer que el mismo se vuelva más amigable con el medio ambiente; entre otras ventajas. Las enzimas se utilizan en una gran variedad de industrias como la alimenticia, textil, papelera, cosmética, farmacéutica; ya sea en alguna etapa de un proceso (panificación, ablandamiento de cuero, blanqueo de papel, síntesis de drogas) o como componente de variados productos (cremas, medicamentos, detergentes). Así, surge la necesidad de disponer de grandes cantidades de enzimas y en algunos casos con altos grados de pureza. Esto ha estimulado la búsqueda de fuentes naturales de enzimas junto con el desarrollo de nuevas técnicas bioseparativas y el perfeccionamiento de la obtención de enzimas recombinantes. Gran parte de los procedimientos tradicionales de purificación de proteínas incluyen varias etapas de precipitación. Para mezclas con baja cantidad de contaminantes y alta concentración de la proteína de interés puede ser un método efectivo de concentración, y en algunos casos, puede actuar como etapa única de purificación, dependiendo del grado de pureza final pretendido. Una de las técnicas empleadas para la precipitación de enzimas es la formación de complejos insolubles con polímeros de cadena flexible cargados (polielectrolitos, PE). Estos complejos pueden separarse de los contaminantes por decantación y pueden utilizarse para purificar, concentrar, estabilizar e inmovilizar a la enzima de interés. Es una técnica simple, rápida, económica, aplicable a gran escala y en condiciones óptimas permite recuperar a la enzima casi en su totalidad (rendimientos superiores al 95 %). La precipitación por formación de complejos insolubles se basa en la interacción principalmente electrostática entre la enzima de interés y un PE. Esta interacción depende del pH, la fuerza iónica, la temperatura, el tiempo y la concentración de ambas especies. Por lo tanto, es necesario conocer las mejores condiciones para optimizar el mecanismo de formación del complejo insoluble. Además, resulta prioritario mantener la estabilidad estructural de la enzima y su actividad catalítica. En esta tesis se estudió la formación de complejos insolubles entre tres PE aniónicos: Eudragit® L-100 (EL100), Eudragit® S-100 (ES100) y alginato (ALG) y la tripsina (TRP), una enzima muy requerida en la industria. Los tres PE empleados se caracterizan principalmente por poseer subunidades con grupos carboxilos, ser biodegradables y tener la capacidad de inducir su insolubilización por cambios en el pH del medio. La TRP es una serin-proteasa que cataliza las escisión del enlace peptídico en el extremo C-terminal de los aminoácidos lisina y arginina. Se produce en el páncreas de los vertebrados como zimógeno (tripsinógeno) y luego es activada por una enteroquinasa intestinal en el duodeno donde actúa degradando las proteínas incorporadas en los alimentos para dar péptidos de menor tamaño y aminoácidos para su posterior absorción. Se emplea principalmente en la clarificación de zumos y cerveza, el ablandamiento de cuero y como componente de detergentes enzimáticos. El estudio de la formación de complejos insolubles entre la TRP y cada uno de los PE es importante ya que sienta las bases para el desarrollo de una técnica bioseparativa aplicable al aislamiento de la enzima a partir de páncreas bovino o porcino que resulta ser un desecho de la industria frigorífica local. En las primeras etapas de este trabajo se investigaron las condiciones óptimas para la interacción entre la TRP y cada PE: se obtuvieron los diagramas de fase de cada polielectrolito y complejo insoluble, las isotermas de titulación turbidimétrica y la cinética de formación de cada complejo insoluble. Los resultados se resumen en la tabla I. A partir de estos datos experimentales se estudió la interacción TRP-PE por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y dispersión de luz dinámica (DLS). Algunos experimentos no pudieron realizarse con el ALG por inconvenientes metodológicos que este polímero presenta. Los experimentos de ITC mostraron que la TRP se une fuertemente con el EL100 y el ES100 en un proceso conducido entrópicamente. Esto indica que los PE interaccionan hidrofóbicamente con la TRP para formar el complejo insoluble. Teniendo en cuenta el efecto inhibitorio de la fuerza iónica sobre la formación del complejo insoluble (también corroborado por ITC) se puede concluir que existe una interacción mixta entre los polímeros Eudragit® y la TRP. Además, los diagramas de fase de cada complejo evidenciaron que la formación de los mismos es dependiente del pH. Por otro lado, los experimentos con ALG demostraron que este PE interacciona electrostáticamente con la enzima, confirmando los datos de turbidimetría. Tanto para los complejos EL100-TRP y ES100-TRP, como para el complejo ALGTRP, los datos experimentales se ajustaron a una función sigmoidea asociada a un modelo de n sitios independientes y equivalentes. Cuando los experimentos de ITC se realizaron a pH 8 se observó que la interacción entre el ALG y la TRP se inhibía totalmente; mientras el EL100 y el ES100 sí interaccionaron con la enzima. Sin embargo, los diagramas de fase de los respectivos complejos no presentaron turbidez a este pH. Esto indicaría que a pH 8 se forma un complejo soluble entre los polímeros Eudragit® y la TRP mediado principalmente por interacciones hidrofóbicas. Los resultados obtenidos por DLS corroboraron todas las observaciones realizadas para los experimentos de ITC a partir de los radios hidrodinámicos calculados para las especies en cada sistema. También se evaluó la estabilidad enzimática por calorimetría diferencial de barrido (DSC), espectroscopía UV-vis, dicroísmo circular (DC) y medidas de actividad catalítica. Los experimentos de espectroscopía UV-vis y DC mostraron que la interacción entre la TRP y cada PE modifican levemente la estructura secundaria y/o terciaria de la enzima . Esta información es muy importante para estudiar de manera simple, rápida y no destructiva la estabilidad de una proteína. Sin embargo, la técnica por excelencia para estudiar estabilidad es la DSC ya que no sólo se aplica en la determinación de parámetros relacionados directamente con la estabilidad térmica de las proteínas (como el Tm) sino que además permite analizar cambios en el mecanismo de desnaturalización de la misma. En ausencia de PE, la TRP presenta su máxima estabilidad a pH 3 mientras que resulta ser menos estable a pH 8. Esto se condice con los importantes cambios estructurales que sufre la enzima al pasar de un pH a otro ya que a pH 3 la enzima se encuentra en una forma inactiva mientras que a pH 8 se observa la máxima actividad catalítica. La presencia del polímero EL100 alteró significativamente la estabilidad térmica de la TRP y su mecanismo de desnaturalización. Cuando el sistema se incubó a pH 5; la estabilidad térmica de la enzima aumentó considerablemente, evidenciado por un aumento del Tm en 10 °C. A pH 8 la TRP también modificó su mecanismo de desnaturalización aunque su estabilidad térmica no se vio afectada por la presencia del PE. Los estudios realizados para el sistema ES100-TRP mostraron que tanto a pH 5 como a pH 8, la presencia del PE estabilizó la estructura proteica contra la desnaturalización térmica; aumentando el Tm en 4 °C y 2 °C, respectivamente. El mecanismo de desnaturalización de la TRP a cada pH también se modifica en presencia de ES100. Otros análisis importantes sobre la estabilidad estructural de la enzima se llevaron a cabo desde el punto de vista de su actividad catalítica; estudiando el efecto de la presencia del PE a distintas concentraciones de polímero y a través del tiempo. Se observó que la actividad enzimática no se modificó en presencia de distintas concentraciones de cada PE. Los experimentos realizados a través del tiempo mostraron que la interacción de la TRP con los Eudragit® aumentó la estabilidad de la enzima, obteniéndose a cada tiempo ensayado mayor actividad enzimática en presencia de los PE que en su ausencia. Por otro lado, el ALG no presentó un efecto estabilizador de la actividad debido a que al pH de formación del complejo insoluble (pH 3,50) la TRP se encuentra en una forma inactiva pero muy estable. Esta información es muy importante ya que resulta indispensable que la enzima no pierda su actividad catalítica al ser purificada si se la quiere utilizar en la industria. Conociendo las condiciones óptimas de interacción TRP-PE y habiendo corroborado que la presencia de los PE no interfiere con la estructura y la actividad de la enzima; se ensayó el método de precipitación en una solución de TRP comercial para determinar el rendimiento de la técnica. Se observó que el ALG es el mejor precipitante de TRP, obteniéndose aproximadamente un 97 % de la enzima en el precipitado. El EL100 logró precipitar el 72 % de la enzima total mientras que el ES100 tan sólo el 41 %. El precipitado ALG-TRP redisuelto se pasó por una columna cromatográfica de interacción hidrofóbica (HIC) con el objetivo de ensayar la separación de la enzima y el PE. Efectivamente, el ALG no eluyó en la misma fracción que la TRP; recuperándose en consecuencia la enzima libre de polímero. Esto puede llegar a ser decisivo en la aplicación de la TRP en la industria alimenticia o farmacéutica, las cuales requieren elevados niveles de pureza en sus productos y/o procesos. Finalmente, se procedió a precipitar TRP a partir de un homogenado de páncreas con EL100 y ALG, los dos PE que dieron los rendimientos más satisfactorios. El EL100 permitió precipitar la enzima aplicando dos protocolos: formación de complejo soluble y posterior insolubilización del EL100; y formación del complejo insoluble EL100-TRP propiamente dicho. El primer protocolo permitió recuperar el 45 % de la enzima total en el homogenado mientras que el segundo permitió recuperar el 82 %. El ALG permitió recuperar casi toda la TRP en el precipitado obteniéndose un rendimiento igual a 98 %. En conclusión, se puede decir que los tres PE son óptimos para la formación de complejos insolubles con la TRP los cuales pueden emplearse en la concentración, estabilización, inmovilización y/o bioseparación de la enzima. Tanto el EL100 como el ES100 estabilizaron la estructura proteica frente a la desnaturalización térmica y a la degradación en el tiempo. Si bien algunos experimentos de estabilidad en presencia de ALG no pudieron realizarse, se observó que no afecta a la actividad catalítica de la enzima. Adicionalmente, el EL100 y el ALG presentaron elevadas capacidades precipitantes lo que los torna excelentes candidatos para purificar e inmovilizar la enzima por precipitación del complejo insoluble.