Diferenciación de vías actuantes en la hiperactivación y reacción acrosómica durante la adquisición de capacidad fecundante en mamíferos - Stival, Cintia Estefanía (2019)
La capacitación es el proceso por el cual los espermatozoides de mamíferos adquieren la habilidad para fecundar un ovocito, y se caracteriza por: 1) un cambio en el patrón de motilidad flagelar (hiperactivación); y 2) adquisición de capacidad para sufrir reacción acrosómica (RA) al enfrentarse a progesterona. Al incubar espermatozoides en un medio capacitante se estimula la activación temprana de la Proteína Quinasa A (PKA), una Ser/Thr quinasa de amplio espectro involucrada en la regulación de distintos procesos celulares. La activación precisa de PKA depende de su adecuada localización en regiones subcelulares concretas. En este sentido, las Proteínas de Anclaje a PKA (AKAPs) forman andamiajes para generar microdominios de señalización y juegan un rol central en restringir la actividad de PKA a sitios específicos. Debido a que los procesos que se desencadenan a partir de la activación de PKA son esenciales para la adquisición de estado fecundante, entender cómo es que esta quinasa se regula en el espacio y tiempo es crucial para descifrar los pasos de la capacitación espermática. En este trabajo utilizamos espermatozoides murinos como modelo para la caracterización de las cascadas de transducción de señales que tienen lugar durante la capacitación. Para estudiar el rol de la interacción PKA-AKAPs se utilizó el péptido inhibidor de anclaje sHT31, en distintos momentos de la fisiología espermática. En primer lugar, validamos el uso de este compuesto, determinando que a las concentraciones de trabajo el péptido no bloquea la actividad catalítica de PKA, pero sí disocia la unión de PKA a AKAP4 en el espermatozoide. Demostramos que el anclaje de PKA a AKAPs es necesario para lograr el estado capacitado, ya que provocar su desanclaje al comienzo de la capacitación resultó en la inhibición de todos los eventos asociados: aparición del patrón de pPKAs, aparición del patrón de pY, hiperpolarización de la membrana plasmática, hiperactivación y capacidad de sufrir RA frente a progesterona. Sin embargo, encontramos que una vez que las células se han vuelto fecundantes, la interrupción repentina de la interacción PKA-AKAPs promueve un rápido influjo de Ca2+ a través del canal CatSper y resulta en la inducción de la RA sin agregado de progesterona. Estos resultados proponen un nuevo evento de señalización que vincula a CatSper con a la reacción acrosómica, en donde el canal es sensible a una activación por PKA provocada por su desanclaje de AKAPs. Por otra parte, debido a que la hiperpolarización del potencial de membrana (Em) es un evento intermedio fundamental en la vía que conduce a la capacidad de RA, y sabiendo que depende de PKA, decidimos estudiar la conexión molecular entre ambos sucesos. En este sentido, los espermatozoides de ratones knock-out en Src no pueden adquirir capacidad de respuesta acrosomal, sugiriendo un rol para la tirosina quinasa en esta vía de señalización durante la capacitación. Por ello, decidimos evaluar la participación de Src en los eventos de la capacitación que conducen a la preparación para desencadenar la RA. Nuestros resultados indican que Src es activada corriente abajo de PKA y que su inhibición bloquea la hiperpolarización del Em sin afectar al patrón de pY que acompaña a la capacitación. Además, la inhibición de Src impidió que los espermatozoides adquieran capacidad de RA frente a progesterona, lo cual pudo revertirse hiperpolarizando farmacológicamente a las células en presencia de inhibidores de Src. Evidencia complementaria sugiere que Src podría activar de manera directa o indirecta al canal de K+ Slo3 para lograr la hiperpolarización del Em durante la capacitación espermática, evento que a su vez es necesario para la adquisición de capacidad de respuesta acrosómica. En conjunto nuestros resultados aportan nuevos datos en el entendimiento de las cascadas de señalización que ocurren durante la capacitación espermática, evidenciando el rol central de PKA como modulador de la misma. PKA podría ser un componente esencial, no sólo en las vías de transducción que conducen a la capacitación, sino también en la regulación de la exocitosis acrosomal una vez que los espermatozoides alcanzaron el estado capacitado. Esta función de PKA requiere tanto de la regulación de su actividad como de su localización subcelular.