Cobre, daño oxidativo y agregación amiloide : un enfoque estructural sobre la proteína α-sinucleína, implicada en la enfermedad de Parkinson - Miotto, Marco César (2017)
El plegamiento anormal de distintas proteínas en una conformación tóxica está propuesto como el componente principal de las bases moleculares de una serie de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (EP). Una característica común y definitoria de dichas enfermedades es la formación y el depósito de agregados proteicos de diversas morfologías, incluyendo fibras amiloides. La neurodegeneración en la EP se caracteriza por la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas en la susbtantia nigra, y por la presencia de agregados fibrilares amiloides citoplasmáticos, conocidos como cuerpos de Lewy, cuyo componente principal es la proteína alfa-sinucleína (AS). La proteína AS está compuesta por 140 aminoácidos distribuidos en tres regiones claramente distinguibles: la región N-terminal anfipática, la región NAC hidrofóbica y la región C-terminal rica en residuos Pro, Glu y Asp.268–273 En su forma monomérica, estado intrínsecamente desordenado, la proteína se describe mejor como un conjunto de conformaciones estructuralmente heterogéneas, sin estructura secundaria persistente y con interacciones de largo alcance entre residuos que se han demostrado importantes para estabilizar conformaciones resistentes a la agregación amiloide. Estos contactos intramoleculares en AS se establecen principalmente entre las regiones N-terminal y C-terminal (interacciones electrostáticas) y entre las regiones NAC y C-terminal (interacciones hidrofóbicas). Aunque no está claro cómo AS puede iniciar la muerte neuronal, lo cierto es que la agregación amiloide de AS es fundamental para los efectos patológicos asociados con la EP. En este sentido, las interacciones entre AS e iones metálicos desempeñan un papel importante en la aceleración de la agregación amiloide y podrían representar el vínculo entre los procesos patológicos de agregación, daño oxidativo y muerte de células neuronales. De hecho, la relación entre la afinidad de AS por los iones metálicos y la eficacia en la que estos aceleran la fibrilación de AS reveló la existencia de una jerarquía de interacciones proteína-iones metálicos que refleja tanto los efectos biológicos como estructurales. Concretamente, la especificidad de unión de cobre a AS indica que el mecanismo a través del cual el cobre impacta sobre la agregación difiere significativamente de la ejercida por otros iones metálicos divalentes. Es por esto que la química de coordinación de cobre a AS ha merecido tanta atención en los últimos años. La mayoría de los estudios sobre la interacción de cobre con AS se ha dirigido a elucidar el entorno de coordinación de Cu(II), y aunque algunos estudios se han centrado en las reacciones de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) catalizadas por cobre, la información relacionada a la estructura, afinidad y reactividad de los complejos proteína-Cu(I) es escasa. La existencia de una química asociada Cu(I)/dioxígeno y la descripción de las características de unión de Cu(I) a AS se ha informado sólo recientemente. Además, datos de voltametría cíclica demostraron que complejos AS-Cu(I) pueden someterse a re-oxidación con generación de H2O2 y otros ROS que son tóxicos para las células dopaminérgicas. Por lo tanto, la elucidación de la base residuo-específico en la coordinación de Cu(I) por AS es central para establecer una conexión entre las características estructurales del complejo AS-Cu(I) y la base mecánistica detrás de los procesos de daño oxidativo y el aceleramiento del ensamblaje amiloide mediado por cobre. Para hacer frente a tal cuestión irresoluta de la química bioinorgánica de la EP, se presenta en este trabajo de tesis doctoral una caracterización estructural detallada de los eventos de oxidación catalizados por cobre, y de la coordinación de Cu(I) por AS, con la asistencia de la técnica espectroscópica de RMN en combinación con proteínas mutantes y péptidos sintéticos modelos. En una primera instancia, se determinó que los residuos Met1 y Met5 constituyen determinantes estructurales claves para la unión de Cu(I) a la región N-terminal de AS y que los mismos mostraron una alta susceptibilidad a la oxidación catalizada por cobre en presencia de oxígeno. Las contribuciones individuales de los residuos Met de la región N-terminal al daño oxidativo y a la unión de Cu(I) se investigaron profundamente. Se demostró que la unión del ión Cu(I) a la proteína AS era capaz de catalizar, en presencia de ácido ascórbico y oxígeno, la oxidación específica del residuo Met1, mientras que los residuos Met de la región C-terminal permanecieron inalterados. Incluso, la proteína AS con el residuo Met1 oxidado presentó un potencial amiloidogénico disminuido. En consecuencia, la cinética de oxidación de Met1 se estudió en detalle y se propusieron las bases químicas de la reacción sitio-específica de oxidación catalizada por cobre. En una segunda instancia, se realizó una deconvolución de las características estructurales y de coordinación de Cu(I) de la proteína AS, motivado por reportes bibliográficos controversiales que utilizaron Ag(I) como modelo iónico de Cu(I). A través de un análisis espectroscópico de RMN detallado, utilizando proteínas mutantes y péptidos sintéticos, se determinó que la unión de Cu(I) a la proteína AS se describe perfectamente como tres sitios de unión independientes y no interactivos. En el sitio 1, los dos átomos Sδ de Met1 y Met5 se encontraron involucrados en la unión de Cu(I), al igual que lo que sucede en el sitio 3, con los átomos Sδ de Met116 y Met127. En el sitio 2, sería el anillo imidazólico de His50 quien tiene el rol de la unión de Cu(I). De manera complementaria, se determinaron los valores de las constantes de disociación aparente (Kdapp) de AS-Cu(I), siendo 20μM para el sitio 1, 50μM para el sitio 2 y 300μM para el sitio 3. Respecto a la arquitectura del sitio 1, la presencia de ambos residuos Met1 y Met5 fue absolutamente necesaria para conservar la unión de alta afinidad de Cu(I) a la proteína, ya que la ausencia de uno de los residuos Met dio lugar a una disminución significativa en los valores de Kdapp. El valor de Kdapp del sitio 1 es consistente con la información reportada para sitios de unión a Cu(I) del tipo Met-X3-Met encontrados en otras proteínas (Kdapp 15-45μM). Además, nuestros resultados exhaustivos obtenidos con Cu(I) corrigieron las discrepancias existentes sobre el escenario planteado para la interacción AS-Cu(I), que había sido sugerida por otros autores del campo a partir de la interacción AS-Ag(I). Finalmente, nuevas evidencias demostraron que AS ocurre fisiológicamente en su forma acetilada en el extremo amino-terminal (acAS).232,284,285 Estudios estructurales mostraron que la modificación post-traduccional de acetilación del grupo α-NH2 de Met1 de AS anula la capacidad de unión de Cu(II) en este sitio pero no se ha reportado su efecto sobre la interacción con Cu(I).172 Por otro lado, el homologo más cercano de AS, beta-sinucleína (BS), presenta el mismo motivo de acetilación y localización subcelular que AS.205 Se ha reportado numerosas veces que BS presentaría propiedades anti-amiloidogénicas y actuaría como un regulador negativo natural de AS, no obstante las bases moleculares de dicho efecto protector se desconocen.37,286 Aunque BS presenta un nivel de homología del 90% en la región N-terminal, la presencia de un residuo Met adicional en posición 10 podría alterar el patrón de interacción con Cu(I). Por lo tanto, se decidió investigar las características de unión de Cu(I) a las proteínas acAS y acBS, utilizando técnicas de RMN de alta resolución y péptidos sintéticos modelos. Se encontró que la acetilación no tiene efecto sobre las propiedades de unión a Cu(I) de ninguno de los sitios de coordinación de AS. Sin embargo, mediante experimentos heteronucleares de RMN que permiten obtener información de la conformación general y la dinámica del esqueleto proteico, se determinó que la unión de Cu(I) a la región N-terminal de acAS induce una estructura secundaria del tipo hélice-alfa estable con propiedades de dinámica restringida en los primeros 10 residuos. Por otro lado, se encontró que la proteína acBS posee tres sitios de unión de Cu(I), que involucran los residuos Met1, Met5 y Met10 en el sitio 1 (Kdapp ~2μM), His65 en el sitio 2 (Kdapp ~50μM) y Met112 en el sitio 3 (Kdapp > 500μM). Además, se encontró que a diferencia de acAS-Cu(I), acBS adopta una estructura helicoidal en los primeros 5 residuos, la cual se ve abruptamente interrumpida por una estructura de giro-beta alrededor del residuo Gly7 que permite el acercamiento de Met10 y la coordinación de Cu(I) por parte del mismo. La diferencia encontrada en afinidad y estructura terciaria inducida por Cu(I) entre acAS y acBS podría ser el puntapié inicial para la comprensión del rol fisiopatológico de acAS y del rol protector de acBS. En conclusión, la información de alta resolución a nivel estructural y molecular que emerge de este trabajo de tesis constituye un paso clave para la comprensión de la base química detrás de la agregación de AS mediada por cobre en la EP. Los resultados presentados establecen una fuerte correlación entre el daño oxidativo, la agregación amiloide y la coordinación de Cu(I), y a la vez constituyen un paso importante hacia la elucidación de las bases mecanísticas y estructurales de la influencia del ión Cu(I) en la etiología de la EP. Del mismo modo, los resultados estructurales de los complejos acAS-Cu(I) y acBS-Cu(I) resultan relevantes en la hora fortalecer la base de conocimiento para favorecer la interpretación biológica en la química bioinorgánica de AS y de iniciar investigaciones para elucidar el rol fisiológico y/o patológico que tiene la inducción de estructura secundaria-terciaria por parte de Cu(I).