Proteínas de unión a heparina en espermatozoides de verraco y su relación con la fecundidad - Dapino, Dora (2010)
1. Métodos para la evaluación de la integridad estructural del acrosoma El acrosoma almacena enzimas y proteínas cruciales para la interacción con el ovocito durante la fecundación, por lo que su evaluación resulta esencial. Las técnicas que evalúan el estado acrosomal (lectinas fluorescentes, contraste de fases, por ejemplo) no representan una alternativa accesible a los fines prácticos debido a que insumen mucho tiempo, su desarrollo es complejo o requieren de un equipo específico e insumos de alto costo que los hace inaplicables a un plan rutinario de control de calidad en los establecimientos que procesan semen porcino. Las técnicas que utilizan colorantes ofrecen una alternativa interesante tanto con fines de investigación, por su estabilidad, como con fines prácticos. Sin embargo, muy pocas de ellas han sido validadas con otras técnicas de evaluación estandarizadas. En este trabajo se evaluó la sensibilidad de la tinción Wells & Awa en detectar cambios paulatinos en la estructura acrosomal comparándola con técnicas estandarizadas como contraste de fases y Giemsa, mostrándose igualmente eficaz en dicha detección por acción de un inductor de reacción acrosómica como el ionóforo o por efecto de la conservación, lo que resulta de utilidad en los establecimientos que almacenan dosis seminales durante varios días. Las ventajas de esta técnica de tinción con respecto a otras, son la posibilidad de utilizar un simple microscopio de campo claro y la estabilidad de los preparados que hace que puedan ser guardados y observados más tarde. Por otro lado, su escaso tiempo de incubación y secado que favorece el mantenimiento de la integridad de las membranas, ofreciendo resultados más fieles y repetibles que otras tinciones de su misma clase. Estas características hacen que esta tinción posea la suficiente versatilidad para ser propuesta como de elección en los exámenes rutinarios de calidad seminal relacionados con la integridad estructural del acrosoma, tanto en la práctica diaria en los establecimientos productores de dosis de semen porcino destinadas a Inseminación Artificial, como en el laboratorio de Investigación. 2. Métodos de evaluación del estado fisiológico del espermatozoide En este trabajo se probaron las técnicas de CTC e Ionóforo de calcio A23187 con el fin de detectar, mediante técnicas microscópicas, las modificaciones estructurales de la membrana del espermatozoide como reflejo de cambios en su estado metabólico. Ambas técnicas mostraron ser eficientes en cuanto a su capacidad de diferenciar y mostrar la evolución del proceso de capacitación como consecuencia de la incubación de los espermatozoides de cerdo en medios capacitantes, obteniéndose valores de capacitación que coinciden con los habitualmente hallados en la especie porcina. 3. Rol de glucosaminoglicano heparina sobre la fisiología del espermatozoide porcino El efecto del glicosaminoglicano sulfatado heparina sobre la capacitación in vitro de espermatozoides porcinos fue evaluado mediante la observación de los patrones de fluorescencia con Clortetraciclina (CTC) y por la habilidad de los espermatozoides de experimentar una reacción acrosómica luego de la exposición a ionóforo de calcio. Los espermatozoides incubados durante 120 minutos en condiciones capacitantes (MC) suplementados con 10 μg/ml de heparina mostraron un incremento del número de espermatozoides capacitados (patrón B) y reaccionados sin afectarse su viabilidad, lo que determinó la elección de estas condiciones experimentales para los trabajos siguientes. Los espermatozoides fueron incubados en MC sin albúmina, calcio o bicarbonato o combinaciones en presencia de heparina. En los medios sin calcio o bicarbonato la capacitación fue basal no mostrando variaciones ante la presencia de heparina. En ausencia de albúmina, la presencia de calcio o bicarbonato estimularon la capacitación, que luego se incrementó con el agregado de heparina. Estos resultados sugieren que la heparina aumenta la capacitación in vitro de los espermatozoides de cerdo sólo en condiciones capacitantes. 4. Naturaleza de la interacción de la heparina con el espermatozoide Se evaluó la presencia, topología y dinámica de las proteínas de unión a heparina (HBP) en el espermatozoide de cerdo. La distribución de HBP se analizó mediante fraccionamiento subcelular utilizando heparina biotinilada seguida de una detección colorimétrica. Las HBP fueron detectadas como proteínas pertenecientes a la membrana periacrosomal del espermatozoide del tipo periféricas e integrales. Mediante microscopía de fluorescencia indirecta de espermatozoides incubados con heparina biotinilada se evidenció la unión de heparina al espermatozoide en diferentes estados fisiológicos. Se observaron dos patrones de fluorescencia diferentes (A y B), que probablemente se correspondan con los estados de espermatozoides no capacitados y capacitados, respectivamente; como se estableció mediante la inducción de la reacción acrosómica de espermatozides capacitados con ionóforo de calcio y la observación del aumento de la fosforilación de la proteína p32. En el patron A, predominante en muestras de espermatozoides no tratados, la fluorescencia se localizó en la región posacrosomal; en el patrón B, observado con mayor frecuencia en muestras de espermatozoides incubados en condiciones capacitantes, la fluorescencia ocupó la región acrosomal. Durante la incubación en medio capacitante (TALP), los espermatozoides mostrando el patrón B aumentaron paulatinamente comparados con espermatozoides no incubados o incubados en condiciones no capacitantes indicando que las modificaciones de los patrones de fluorescencia de HBP están probablemente relacionados con la capacitación. Cuando los espermatozoides fueron incubados con 100 μg/ml de heparina biotinilada en presencia o ausencia de heparina no marcada se observó que los sitios de unión a heparina se localizaron principalmente en la región acrosomal del espermatozoide de cerdo de manera específica y saturable. El efecto in vitro de la heparina observado en este trabajo indica que este glicosaminoglucano sulfatado, normalmente presente en el tracto reproductivo femenino podría cumplir un rol importante en el proceso de fecundación en porcinos. No se observaron diferencias cuando espermatozoides no tratados fueron permeabilizados con metanol o tritón antes de la tinción, lo que indica que las HBP se localizan en la superficie espermática. El efecto de la heparina sobre la fosforilación en tirosina de proteínas espermáticas por efecto de la capacitación fue también analizado encontrándose una disminución en la fosforilación de la proteína p32 en presencia de heparina. Esto sugiere que el incremento de la capacitación mediado por este glucosaminoglicano podría involucrar un proceso de señalización celular alternativo o ser el resultado de la pérdida de estas proteínas por efecto de la RA, hecho que se observa aumentado con el agregado de heparina en los medios de incubación. El hallazgo de que la heparina se une al espermatozoide en forma diferencial de acuerdo con su estado fisiológico es una nueva evidencia de la remodelación de la superficie de la membrana por efecto de la capacitación y podría proveer un método útil y relativamente simple para la evaluación in vitro de las modificaciones del estado fisiológico del espermatozoide porcino. 5. Caracterización del rol de la heparina en la unión del espermatozoide a la Zona Pelúcida. Con el fin de evidenciar el efecto de la heparina sobre la unión de los espermatozoides a ZP se utilizó el método del cubreobjetos cubierto de ZP. Al adicionar espermatozoides incubados bajo condiciones capacitantes y en presencia de heparina a los cubreobjetos, el número de espermatozoides unidos fue significativamente menor comparado con aquellos incubados en ausencia de heparina. En los cubreobjetos no tratados, el número de espermatozoides unidos fue mínimo y no varió significativamente a lo largo de todo el proceso de incubación, independientemente de la presencia de heparina. Este resultado se podría explicar considerando el hecho de que la ZP contiene cierto número de dominios polisulfatados que posiblemente competirían con la heparina. La mayoría de las HBP permanecen unidas al espermatozoide después de la capacitación, interviniendo algunas de ellas, como AWN-1 y DQH, en la unión primaria del espermatozoide a la ZP y es a estas proteínas a las que se uniría la heparina, hecho que sugiere que los glucosaminoglicanos de su tipo presentes en el tracto femenino podrían estar implicados en la preselección espermática y así contribuir a la prevención de la polispermia. 6. Las HBP como indicadoras de fecundidad en verracos En este trabajo se procedió a la detección de posibles diferencias en la unión a heparina de muestras de espermatozoides de animales con diferentes grados de fecundidad in vivo. Se procedió a clasificar inicialmente a un grupo de reproductores porcinos, cuyos parámetros de calidad seminal no mostraban diferencias en relación con los valores habituales de normalidad preestablecidos para la especie porcina, en dos grupos (I y II) en función de diferencias en cuanto a su Tasa de Parto (hembras paridas/hembras inseminadas), perteneciendo al grupo I los individuos con una tasa de fecundidad mayor o igual al 70 % y al grupo II, individuos con una tasa menor al 70 %. Muestras de semen de cada individuo fueron evaluadas mediante microscopía de fluorescencia indirecta utilizando la técnica de incubación de espermatozoides previamente incubados en condiciones capacitantes, con heparina biotinilada y revelado con streptavidina-FITC. Se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje de espermatozoides que muestran patrón B de fluorescencia en 2 animales pertenecientes al grupo II, los que muestran un porcentaje significativamente menor de fluorescencia en la región acrosomal en todos los tiempos de incubación testeados. Considerando que las HBP AWN-1, AQN-3 y DQH son retenidas en la membrana espermática luego de la capacitación interviniendo como receptores primarios en la unión ovocito-ZP, una disminución en la densidad de estas proteínas sobre la membrana del espermatozoide porcino podría estar reflejada en la disminución en el porcentaje de espermatozoides que unen heparina en la región acrosomal luego de capacitados (patrón B) observada en algunos individuos. En función de los valores de fecundidad inferiores observados para estos mismos animales este resultado estaría identificando, dentro de una población de reproductores aptos para la Inseminación Artificial, una subpoblación de individuos con menor capacidad fecundante (subfecundidad), característica que no se refleja en los análisis comúnmente utilizados para la evaluación de la calidad del semen porcino destinado a la Inseminación Artificial.