Impacto de reacciones de halogenación sobre la composición y las actividades biológicas de mezclas complejas naturales - García, Paula (2016)
Un paso limitante en la búsqueda de nuevas drogas es el acceso a bibliotecas de compuestos con propiedades biológicas interesantes. Los productos naturales (PNs) han sido muy valiosos como plataforma validada biológicamente por contener esqueletos moleculares que presentan dichas cualidades. Una metodología que utiliza a los PNs como punto de partida para la generación de compuestos con potencial actividad biológica es la Diversificación Química de Extractos. La misma apunta a producir cambios en las estructuras químicas de los componentes de extractos naturales a través de reacciones químicas seleccionadas. Estos cambios consisten en la introducción de grupos funcionales o de elementos atípicamente encontrados en derivados de origen natural, a través de reacciones que transforman grupos funcionales de alta presencia en PNs tales como los dobles enlaces y los anillos aromáticos. La incorporación de átomos de halógeno en PNs de origen vegetal resulta interesante puesto que: (a) es una estrategia comúnmente utilizada en química medicinal para alterar bioactividades de moléculas orgánicas. (b) la proporción de halógenos presentes en drogas es significativamente mayor que en PNs. (c) la mayor parte de los PNs halogenados son producidos por organismos marinos, siendo este tipo de metabolitos muy raros en otro tipo de vegetales. (d) existen reactivos que podrían introducir este tipo de elementos a través de grupos funcionales muy comunes en metabolitos secundarios tales como los dobles enlaces o los anillos aromáticos. Entre los diferentes halógenos a introducir, se seleccionó inicialmente al bromo, fundamentalmente porque presentó facilidades experimentales para su introducción en mezclas complejas. Cuando se utiliza la diversificación química de extractos, tanto el seguimiento de las reacciones como el monitoreo de su efecto sobre diferentes propiedades de las mezclas se ven dificultados tanto por la complejidad de las mezclas de partida y de las mezclas producto, como por el desconocimiento de su composición química exacta. Para llevar adelante este seguimiento se efectuó la comparación de sus (a) perfiles químicos y (b) perfiles de bioactividades. (a) Los perfiles químicos tienen como objeto estimar el éxito de la reacción y su impacto en la composición. Con “éxito de la reacción” nos referimos a tratar de observar cambios en propiedades relacionadas a los grupos funcionales de alta presencia a modificar o a elementos que se desea introducir en la mezcla. Con “impacto de la reacción” nos referimos al grado en que la composición química es alterada por la reacción. Para estos análisis se utilizaron métodos cromatográficos, espectroscópicos o combinaciones de éstos, acoplados a análisis estadístico multivariado. (b) La comparación de perfiles de diferentes actividades biológicas entre los extractos de partida y los extractos halogenados se realizó a través ensayos autográficos sobre placas cromatográficas. Dado que estos métodos autográficos permiten combinar la capacidad separativa de la cromatografía en capa delgada (CCD) con la determinación in situ de la actividad biológica de los componentes de una mezcla de compuestos químicos, permiten pre-asignar de manera cualitativa actividades biológicas observadas en una mezcla a uno o más de los componentes de la misma. Con este fin, se utilizaron ensayos autográficos previamente descriptos para detectar compuestos antioxidantes e inhibidores de acetilcolinesterasa, xantina oxidasa y β-glucosidasa. Además se desarrollaron durante esta tesis dos ensayos autográficos enzimáticos, un ensayo para detectar inhibidores de tirosinasa y uno para detectar inhibidores de acetilcolinesterasa compatible con CCD sobre fase reversa (FR). Siendo la principal dificultad en el desarrollo de este tipo de ensayos enzimáticos encontrar las condiciones adecuadas para lograr buena reproducibilidad, homogeneidad de color, buena definición de halos y ausencia de resultados falsos, en esta tesis se estudiaron las ventajas del uso de geles como soportes enzimáticos. Además, se utilizaron diseño experimental y métodos de optimización multicriterio (Métodos de Superficie de Respuesta y uso de funciones de deseabilidad) para buscar condiciones de ensayo óptimas. Esto permitió encontrar condiciones en las que los dos nuevos ensayos presentan buena sensibilidad para la detección para inhibidores conocidos de las enzimas presentes en mezclas complejas. En un principio se bromaron 7 extractos de malezas siguiendo dos protocolos, uno utilizando bromo en solución y otro utilizando bromo inmovilizado en un soporte sólido. La comparación de los espectros de resonancia magnética nuclear de protones (RMN de 1H) combinada con análisis de componentes principales (ACP) permitió observar la separación de las muestras en grupos correspondientes a extractos naturales y a extractos modificados. El análisis del gráfico de loadings del CP2, principal responsable de la separación de los grupos, muestra que los bins con mayor efecto en este CP corresponden a una zona de desplazamiento químico de señales de dobles enlaces, uno de los grupos blanco de la reacción. Estos resultados sugieren que a pesar de que las mezclas de partida y producto son complejas y de composición mayoritariamente desconocida, existen diferencias entre estas composiciones y que estas diferencias se centran en uno de los grupos blanco de la modificación química. Este análisis se complementó utilizando cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masa de alta resolución (CLAE-EMAR), al menos un 85% de los picos presentes en los extractos testigo (ETs) desaparecen debido a la reacción (en promedio desaparece el 92 %). Paralelamente, se observa que en promedio un 90% de los picos presentes en los extractos bromados son producto de la reacción. En general lo resultados fueron muy similares para los extractos bromados producidos con ambos protocolos de reacción. Por su parte la reacción de bromación con resina provoca la desaparición de al menos un 68 % de los picos presentes en los ETs (93 % en promedio), mientras que los picos cromatográficos que aparencen en los extractos bromados como resultado de la reacción representan el 88 %. La combinación de estos datos con un ACP mostró nuevamente la discriminación de los extractos en dos grupos, uno que incluye a los testigos y otro que incluye a los modificados. De este grupo de extractos modificados, la actividad biológica más interesante se obtuvo para el extracto de Medicago lupulina L. modificado con bromo en solución, el cual presento actividad inhibitoria de la enzima β-glucosidasa. Se fraccionó el mismo por columna cromatográfica (CC) de sephadex LH-20, en este fraccionamiento se encontraron 6 fracciones que resultaron activas, las cuales se analizaron por EM mediante infusión directa en modo de ionización negativo. Entre los iones moleculares presentes en cada fracción se encuentran cuatro iones moleculares que tienen el patrón isotópico característico de los compuestos que contienen bromo en su estructura. Si bien a partir de este análisis no puede adjudicarse la actividad a ninguno de los iones moleculares nos permite corroborar que hay compuestos bromados en las fracciones activas. Con el fin introducir nuevas mezclas complejas como material de partida, posteriormente se realizó la bromación de 32 aceites esenciales (AEs) utilizando bromo en solución. Los perfiles químicos de los aceites esenciales bromados (AEBs) generados fueron comparados con aquellos de los AEs que le dieron origen utilizando CCD, RMN de1H y cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (CG-EM), observando en todos los casos diferencias interesantes. A partir de los espectros de RMN de 1H se realizó un ACP, observandose que las mezclas se separan en el CP2 en dos grupos. El gráfico de loadings del CP2 reveló que los bins con mayor influencia sobre este componente principal corresponden a zonas de desplazamiento químico de señales de dobles enlaces, dobles enlaces conjugados con anillos aromáticos y protones de metilos de alcanos en posición α a dobles enlaces. Estos resultados indican que las diferencias observadas se centran en grupos blanco de la modificación química o en grupos adyacentes a estos. Las 64 mezclas fueron además analizadas por CG-EM detectando importantes diferencias en los perfiles químicos de los AEs respecto a los AEBs. En promedio el 90 % de los picos detectados en los cromatogramas de los AEs desaparecen como resultado de la reacción y el 96 % de los picos presentes en los AEBs están ausentes en los AEs, es decir representan compuestos nuevos generados por la reacción. Además se observó que el número de compuestos promedio en los AEBs es casi el doble que en sus mezclas precursoras y que el 64 % de los compuestos generados incorporaron al menos un átomo de bromo. En conjunto estos resultados demuestran el alto impacto que tiene la reacción de bromación en la alteración de la composición química de los AEs. La evaluación de las propiedades biológicas se realizó a través de cuatro ensayos autográficos enzimáticos y dos ensayos químicos, observando interesantes cambios resultantes de la reacción. Considerando la totalidad de las muestras, el número de halos de inhibición generados por la reacción (ausentes en los AEs de partida) fue significativo. Dependiendo de la actividad biológica evaluada, entre el 54 % y el 89 % de los halos observados en los AEs bromados fueron resultantes de la reacción. El mayor impacto en las propiedades biológicas de estas mezclas fue observado en la actividad inhibitoria de xantina oxidasa, donde el porcentaje de activos presentes en los aceites bromados y ausentes en los aceites esenciales de partida es mayor al 80 %. Dos de los aceites esenciales bromados bioactivos, fueron sometidos a fraccionamiento bioguiado con el objeto de aislar los compuestos responsables de las actividades observadas en las mezclas. Uno de los halos más interesantes en los ensayos de actividad inhibitoria de las enzimas tirosinasa y xantina oxidasa fue presentado por el aceite esencial bromado de Foeniculum vulgare Mill. Su fraccionamiento mediante cromatografía, guiado por autografía para la detección de inhibidores de tirosinasa llevó al aislamiento e identificación del compuesto 2-bromo-1-(4-metoxifenil) propan-1-ona (1). A los fines de identificar al compuesto inhibidor de xantina oxidasa presente en este mismo aceite esencial modificado de F. vulgare se aplicó la metodología BIOMSID (del inglés, BIOautography coupled to Mass Spectrometry for the IDentification of compounds), que permite acoplar EMAR con halos de inhibición bioautográficos. De esta manera se verificó que la fórmula molecular correspondiente al compuesto activo era C10H11BrO2, observando el correspondiente patrón isotópico característico de compuestos bromados en el espectro de masa. De esta forma, se corroboró rápidamente que el compuesto responsable de la actividad inhibitoria para ambas enzimas era el mismo. A fin de cuantificar la actividad inhibitoria de este compuesto frente a las enzimas tirosinasa y xantina oxidasa se realizaron ensayos en microplaca. En el ensayo de tirosinasa el compuesto presento una concentración inhibitoria media (CI50) de 21,40 μM, siendo 1,96 veces más activo que el inhibidor de referencia ácido kójico (CI50 42,16 μM). Con respecto a la actividad inhibitoria xantina oxidasa el compuesto presento una CI50 de 5,90 μM, siendo compuesto 2,26 veces menos activo que el alopurinol (CI50 2,60 μM). Paralelamente, el AEB de Artemisia dracunculus L. presentó dos halos interesantes en el ensayo de actividad inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa, por lo cual se realizó su fraccionamiento bioguiado mediante cromatografía en columna. Se aislaron e identificaron dos compuestos activos: 1-(2,3-dibromopropil)-4-metoxibenceno (2) y 1-(1,3-dibromopropan-2-il)-4-metoxibenceno (3). La actividad inhibitoria de estos compuestos frente a la enzima acetilcolinesterasa se cuantificó a través de ensayos en microplaca observando que ambos son débiles inhibidores. El compuesto 2 posee una CI50 de 88,47 μM y el compuesto 3 posee una CI50 de 70,93 μM, siendo ambos más de 100 veces menos activos que el inhibidor de referencia fisostigmina (CI50 0,63 μM). En vistas de la gran importancia del flúor en química medicinal y de que los metabolitos conteniendo flúor son minoritarios dentro de los PNs halogenados, se realizó la fluoración de 12 aceites esenciales (AEs). Los perfiles químicos de los aceites esenciales fluorados (AEFs) generados fueron comparados con aquellos de los AEs que le dieron origen utilizando CCD, RMN de1H, RMN de 19F y CG-EM, observando en todos los casos diferencias interesantes. Los espectros de 19F de los AEFs mostraron un número variable de señales, que no fueron observadas en los espectros de los AEs de partida, indicando la incorporación de este elemento en los componentes de las mezclas. A partir de los espectros de RMN de 1H se realizó un ACP, observándose que las mezclas se separan en el CP3 en dos grupos: los AEF presentan valores mayores a 8 para el CP3, en tanto que todas las mezclas de partida mostraron valores por debajo de 7 para dicha variable. Las 24 mezclas fueron además analizadas por CG-EM detectando importantes diferencias en los perfiles químicos de los AEs respecto a los AEFs. En este análisis se observó que en promedio el 90 % de los picos detectados en los cromatogramas de los AEs desaparecen como resultado de la reacción y que el 96 % de los picos presentes en los AEFs están ausentes en los AEs, es decir representan compuestos nuevos generados por la reacción. Además se observó que el número de compuestos promedio en los AEFs es casi cuatro veces mayor que en sus mezclas precursoras. Demostrando de esta forma el alto impacto que tiene la reacción de fluoración en la alteración de la composición química de los AEs. Los datos obtenidos por CG-EM fueron además transformados a un formato bidimensional, y procesados estadísticamente (ACP). De manera similar a lo observados para los datos de RMN, la población se separa en dos grupos, uno correspondiente a los AEFs y otro a los AEs de partida. Estos resultados en conjunto (CCD, RMN1H y 19F, RMN1H-ACP, CGEM y CGEM-ACP) demuestran la factibilidad de generar compuestos organofluorados a partir de esqueletos de origen natural por medio de reacciones de fluoración. Al analizar los cambios en las propiedades biomoleculares de los AEFs, los resultados más interesantes fueron obtenidos para los AEFs de A. dracunculus y O. basilicum en cuanto a su capacidad inhibitoria de la enzima tirosinasa. Ambos AEFs presentaron 3 halos nuevos de inhibición luego de la reacción de fluoración que eran aparentemente los mismos. A fin de determinar los compuestos responsables de la actividades detectadas, se realizó la fluoración de metilchavicol, uno de los constituyentes principales de los AEs de partida. Esta reacción condujo al aislamiento y a la identificación de los tres compuestos inhibidores de tirosinasa: 4-allil-2-fluoro-1-metoxibenzeno (4), 1-allil-2-fluoro-4-metoxibenzeno (5) y 4-fluoro-4-propenilciclohexa-2,5-dienona (6). A fin de cuantificar la actividad inhibitoria de la enzima tirosinasa se realizaron ensayos en microplaca: el metilchavicol resultó ser inactivo en el rango de concentraciones ensayado, en tanto que los compuestos 4 (CI50 =97,48 μM) y 5 (CI50 =174,20 μM) resultaron débiles inhibidores. El resultado más destacado fue el obtenido para el compuesto 6 para el que se determinó un valor de CI50 de 59,14 μM, actividad similar a la reportada para uno de los inhibidores de referencia para este blanco terapéutico como es el ácido kójico el cual presentó, en las mismas condiciones de experimentación, un valor de CI50 de 42,16 μM. Como resumen, durante este trabajo de tesis doctoral se modificaron 7 extractos de malezas utilizando dos protocolos de bromación diferentes (bromación en solución y con resina perbromada), 32 aceites esenciales mediante bromación en solución y 12 aceites esenciales mediante fluoración directa. Además se desarrollaron dos nuevos ensayos autográficos para detección de inhibidores de tirosinasa y de acetilcolinesterasa, este último compatible con CCD-FR. Se realizó el aislamiento bioguiado y la caracterización química y biológica de 6 compuestos activos generados a través de reacciones de halogenación.