Análisis funcional del complejo MutSγ de Arabidopsis thaliana - Gómez, Rodrigo Lionel (2012)
El sistema MMR, constituye uno de los pilares fundamentales del mantenimiento de la estabilidad génica de todos los organismos. Su funcionalidad está altamente relacionada a los pasos post replicativos, sin embargo, han sido propuestos roles adicionales del sistema entre los que se encuentra la corrección de lesiones oxidativas sobre el ADN. El sistema MMR se encuentra conservado desde organismos procariotas a eucariotas, presentando mayor complejidad en estos últimos. El paradigma bacteriano se estableció en primer lugar en E. coli donde existen tres homodímeros específicos del sistema denominados MutS, MutL y MutH. En eucariotas, se ha demostrado la existencia de parálogos de MutS (denominados MSHs) y de MutL (denominados MLH y PMS) que forman heterodímeros funcionales específicos. Sin embargo, no existen homólogos eucariotas de MutH. El primer paso del sistema involucra el reconocimiento de lesiones en el ADN, principalmente apareamientos incorrectos o desapareamientos de bases, por complejos del tipo MutS. En eucariotas existen dos heterodímeros conservados que difieren en su especificidad de reconocimiento de lesiones. El primero se denomina MutSα y está formado por las subunidades MSH2 y MSH6, mientras el segundo se denomina MutSβ y se encuentra conformado por las subunidades MSH2 y MSH3. En A. thaliana y otras plantas estudiadas existe un tercer parálogo de MutS denominado MSH7. Esta subunidad forma junto con MSH2 el complejo heterodimérico MutSγ. Existen numerosos estudios sobre el sistema MMR en bacterias, células humanas y levaduras, sin embargo, el conocimiento del mismo en plantas es aún escaso. Ante este escenario se planteó como uno de los objetivos del presente trabajo extender el conocimiento sobre el sistema MMR de plantas, principalmente centrándose en el rol del complejo MutSγ, exclusivo de estos organismos. Adicionalmente, se estudió la relación del sistema MMR con la reparación del daño oxidativo en el ADN. En primer lugar, se expresó la subunidad AtMSH2 en un sistema bacteriano y se purificó a homogeneidad con la finalidad de utilizar esta proteína en futuros ensayos bioquímicos in vitro. Adicionalmente, se utilizaron anticuerpos generados contra esta subunidad para demostrar la existencia de un ortólogo de MSH2 en inflorescencias de Brassica olaracea, especie relacionada filogenéticamente con A. thaliana. La presencia de la proteína en inflorescencias sería importante para mantener la fidelidad genética durante la siguiente generación. De hecho, también se observó que los niveles transcripcionales del gen MSH2 en A. thaliana son 70 veces superior en callos con respecto a los valores de plántulas, asociado probablemente a la mayor tasa de replicación existente en estos tejidos. Los niveles de expresión de los genes MSH2, MSH6, MLH1 y PMS1, también, se evaluaron en plantas salvajes sometidas a condiciones de estrés oxidativo, por tratamiento con MV y estrés salino, por tratamiento con NaCl. En general, todos los genes mostraron un aumento en su expresión en relación a las condiciones control, sin embargo, los incrementos dependieron del gen en estudio y del tratamiento. AtPMS1 fue el único gen que mostró una disminución en su expresión relativa cuando se estudió el efecto de NaCl. Estos experimentos se extendieron a estudiar el efecto del estrés oxidativo y salino en plantas de A. thaliana salvajes o mutantes en el gen MSH2. Se observaron disminuciones de las cantidades de clorofilas a y b y en la elongación de raíces, tanto en plantas salvajes (control) como en plantas mutantes sometidas a tratamientos de estrés. Adicionalmente, se observó una mayor acumulación de bases oxidadas, 8-oxoG, en el ADN de plantas sometidas a estrés oxidativo, sin evidenciarse diferencias atribuibles a los genotipos. En conjunto, estos datos no permiten establecer una relación directa entre el sistema MMR y la reparación del daño oxidativo en el ADN. Finalmente, se caracterizó la función de AtMutSγ en un sistema in vivo. Para ello, se expresaron las subunidades AtMSH2 y AtMSH7 en un huésped heterólogo. La expresión funcional del complejo se confirmó mediante ensayos de cambios de movilidad electroforética y medidas de tasas de mutaciones de distintos marcadores moleculares. A partir de la comparación de las tasas de mutaciones, se determinó que la expresión de AtMutSγ produce un aumento en la frecuencia de mutaciones del tipo de sustitución de bases en el ADN, evidenciada por uno de los genes reporteros utilizados (CAN1). El análisis del espectro mutacional de CAN1 permitió confirmar que el aumento en la tasa de mutaciones se debe a sustituciones de bases. Adicionalmente, los resultados obtenidos permitieron inferir cierta especificidad de reconocimiento de AtMutSγ, mediante la prevalencia de ciertas sustituciones sobre las demás. Estas sustituciones involucran los cambios de T por A, C o G y de G por A en la hebra codificante del CAN1. De esta forma, AtMutSγ reconocería preferencialmente los apareamientos incorrectos que causan estas mutaciones. Estos datos, abren nuevas perspectivas para continuar avanzando en la elucidación de las bases moleculares y bioquímicas de este sistema de reparación en plantas.