Interacción de proteínas de adhesión celular con la proteína E6 derivada de Papilomavirus humanos de alto riesgo y su relación con la oncogénesis - Facciuto, Florencia Natalia (2014)
Los VPH de alto riesgo, como VPH 16 y 18, se asocian con el desarrollo de carcinomas de cuello de útero y de las lesiones neoplásicas precursoras. Dado que el cáncer cervical representa, después del de mama, el segundo cáncer más frecuente entre mujeres de todo el mundo, VPH es considerado un importante agente carcinogénico (http://www.msal.gov.ar). Las funciones oncogénicas de VPH residen en las proteínas virales E6 y E7 que interfieren con proteínas celulares regulatorias. Entre los blancos celulares de E6 se encuentran proteínas con dominios proteicos específicos denominados PDZ (PSD‐95, DLG1, ZO‐1) (Thomas et al., 2008b). Los dominios PDZ son motivos conservados y específicos de reconocimiento proteína‐proteína que permiten el reclutamiento de péptidos y la formación de complejos multiproteicos en sitios especializados de la membrana, con función en la transmisión de señales (Javier and Rice, 2011). Muchas de estas proteínas son componentes de las uniones intercelulares y participan del mantenimiento de la polaridad celular. La interacción entre E6 y proteínas PDZ involucra la región C‐terminal (T/SXV/L) altamente conservada de E6, que constituye un sitio de unión consenso a dominios PDZ (PBM), y se ha demostrado que en algunos casos esta interacción resulta en la degradación de las proteínas PDZ (Gardiol et al., 1999; Thomas et al., 2002). Por otro lado, la pérdida de polaridad celular es un evento clave en el desarrollo de carcinogénesis y su regulación depende, en parte, de la integridad de las UT (Aranda et al., 2008). Basados en esta información y con el objetivo de analizar la interferencia de la proteína E6 de VPH sobre con la estructura de las UT, en el Capítulo 1 analizamos la expresión de uno de los componentes del complejo de polaridad celular PAR, la proteína PAR 3. Dicha proteína contiene tres dominios PDZ con las cuales potencialmente las proteínas E6 de VPH de alto riesgo podrían interaccionar; además, otros autores señalaron una interacción débil en ensayos in vitro de PAR 3 con E6 18 (Tomaic et al., 2008). PAR 3 es un elemento clave para la conformación de las UT, por lo tanto el estudio de la interferencia de E6 sobre ella podría explicar la pérdida de la arquitectura celular observada en carcinomas asociados a VPH. Mediante ensayos de IF observamos que la expresión de E6 16 o de E6 18 altera la localización de PAR 3, tanto utilizando cultivos convencionales como en cultivos histotípicos, los cuales fueron optimizados por primera vez en el Laboratorio. Asimismo, pudimos comprobar que el PBM de E6 18 es fundamental para dicha función, ya que la expresión de una mutante en el PBM de E6 18 no altera la localización de PAR 3. Por otro lado, pudimos comprobar interacción in vivo entre PAR 3 y E6 18, de una manera PDZ-dependiente. Comprobamos que dicha interacción no tiene como consecuencia la degradación proteica de PAR 3, como ocurre con otras proteínas blanco de E6 conteniendo dominios PDZ, como Scribble y DLG1 (Gardiol et al., 1999; Nakagawa and Huibregtse, 2000). Por ensayos de fraccionamiento celular, demostramos la relocalización citoplasmática y nuclear de PAR 3 en aquellas células que expresan E6 18. Estos datos sugieren que los cambios en la ubicación subcelular de PAR 3, y su ausencia en el contacto célula-célula podrían contribuir con la transformación maligna y los procesos carcinogénicos en general, ya que para llevar a cabo sus funciones regulatorias, PAR 3 necesita adquirir una localización asociada a membrana en la región apical (Pieczynski and Margolis, 2011). Para explicar las diferencias de localización de PAR 3 observadas, investigamos los probables mecanismos celulares que puedan mediar dicho cambio. Para lo cual analizamos en primera instancia, la interferencia que pudiera tener E6 sobre otros componentes del complejo PAR, como aPKC (Joberty et al., 2000). Los resultados indicaron que la proteína aPKC se encuentra activada en líneas celulares derivadas de carcinoma cervical, como HeLa o CaSki, lo que podría tener consecuencias sobre las proteínas que aPKC fosforila. Sin embargo, E6 no contribuye a dicha activación siendo desconocidos los mecanismos implicados. Asimismo, la polaridad celular también requiere la correcta distribución de lípidos de membrana de tipo PIs, que a su vez están involucrados en los mecanismos de traducción de señales importantes para el control de la proliferación celular (Martin-Belmonte and Mostov, 2007). La proteínas celulares PDZ presentes en las UT interaccionan con este tipo de lípidos y esta interacción es relevante para la correcta distribución de PIs (Ivarsson et al., 2013). Por ello, investigamos si la unión PDZ-E6 podría interferir con la localización y función de tales lípidos. Con este propósito, analizamos las diferencias en la distribución de PIs en presencia o ausencia de las proteínas E6 usando un biosensor fluorescente de PI(4,5)P2, el dominio pleckstrina de la fosfolipasa C conjugado a GFP (Varnai and Balla, 2006). Demostramos que la expresión de la proteína E6 induce una redistribución de PI(4,5)P2, reduciendo su presencia en los bordes celulares. Más aún, esta alteración no se observó para el caso de la proteína E6 derivada de un tipo de VPH no oncogénico el cual carece de la capacidad de interaccionar con dominios PDZ. Además, células derivadas de carcinomas asociados a VPH mostraron un patrón totalmente alterado respecto a la localización de PI(4,5)P2, con una distribución tipo puntillado en el citoplasma. Para analizar si E6 interfiere en la interacción PDZ-PIs optimizamos análisis de interacción lípidos-proteínas in vitro utilizando tiras comerciales conteniendo PIs (Echelon, EE.UU.). Luego de poner a punto la técnica, pudimos demostrar que la presencia del PBM de E6 18, o de la proteína completa, interfiere en el patrón de unión PIs-PAR 3. Esto último podría implicar cambios en la localización en membrana de dicha proteína, así como también podría explicar los cambios en la localización subcelular de distintas proteínas PDZ en células VPH-positivas, que dependen de la interacción con PIs para su correcta distribución. También es importante destacar que es posible que dichos cambios en la localización de PAR 3 se deban a interferencias de E6 sobre otros blancos celulares que forman parte de otros complejos de polaridad. Esto último considerando que existe una interdependencia entre los distintos elementos que conforman el network de proteínas que regulan la polaridad en células epiteliales (Coradini et al., 2011). Es por ese motivo que en el presente trabajo de Tesis analizamos la intercomunicación que existe entre los componentes del complejo de polaridad SCRIB [proteínas Scribble y DLG1, blancos PDZ de E6 (Pim et al., 2012)] y PAR·3. Por técnicas de silenciamiento pudimos corroborar que la ablación de DLG1 o de Scribble afecta de manera significativa la distribución subcelular de PAR 3 en la línea celular HaCaT. Por lo tanto, los cambios observados en la localización en células que expresan E6 derivado de VPH de alto riesgo podrían deberse, en parte, a la interferencia de E6 sobre componentes del complejo SCRIB. Es importante destacar también, que es la primera vez que se describe una dependencia en la localización de PAR 3 mediada por DLG1 y/o Scribble. Por último, teniendo en cuenta que mucho de los blancos de E6 son proteínas que pertenecen a complejos de polaridad y a las uniones intercelulares, decidimos analizar la interferencia de E6 sobre la formación de las UT y la polarización. Para tal fin utilizamos ensayos de cambio en la concentración de calcio (McNeil et al., 2006). En primer lugar, optimizamos por primera vez la técnica en el laboratorio, y analizamos la relocalización celular de ZO1 en células que expresaban o no E6 18. Los resultados indicaron que la presencia de E6 produce un retardo en la localización de ZO1, proteína clave para las UT. Por lo tanto, un retardo en la reformación de las uniones intercelulares indicaría una disfunción de los mecanismos que regulan la polaridad celular en células que expresan E6 18. El retardo observado en la repolarización celular puede deberse a la interacción de E6 con algunos de los blancos que regulan la polaridad celular, los cuales fueron descriptos anteriormente. Es importante mencionar que el retardo en la repolarización se observa en estadios tempranos de la formación de las uniones celulares. Se ha descripto recientemente que PAR 3 es una de las proteínas que participa en la formación temprana de tales uniones (Iden et al., 2012); por lo tanto, la alteración en su localización podría considerarse un mecanismo probable que explique lo observado en los ensayos de cambios de la concentración de calcio. Los datos obtenidos sugieren que los VPH oncogénicos tienen la capacidad de interferir con elementos claves de las UT, con probables implicancias en el mantenimiento de la polaridad celular. En resumen hemos demostrado que E6 es capaz de alterar la localización subcelular de PAR 3, sin producir cambios en los niveles de dicha proteína. Los cambios de localización pueden tener efectos dramáticos en la polaridad apicobasal que es regulada por PAR 3, entre otras proteínas. Es importante destacar que la expresión de PAR 3 se encuentra alterada en una amplia variedad de tumores (Facciuto et al., 2012) y que se ha demostrado su función como un inhibidor de metástasis en modelos de cáncer de mama (Iden et al., 2012; McCaffrey et al., 2012). De esto se desprende que los hallazgos presentados aportan significativamente al conocimiento de los mecanismos relacionados a las transformaciones malignas asociadas a las infecciones con VPH, ya que alteraciones en los patrones de expresión de PAR 3, como los descriptos en esta Tesis podrían contribuir a la progresión maligna de las lesiones cervicales.