Evaluación de las propiedades estructurales, funcionales y biológicas de proteínas lácteas modificadas enzimáticamente - Mancilla Canales, Manuel Arturo (2015)
Las caseínas y su correspondiente sal de sodio y calcio son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria debido a sus propiedades fisicoquímicas, nutricionales y funcionales, las cuales las convierten en ingredientes valiosos en formulaciones alimenticias complejas. Por otra parte, el suero lácteo constituye cerca del 85-90% del volumen de leche usado para elaborar quesos, y retiene un 55% de los nutrientes. Las proteínas del lactosuero han llamado la atención por su elevado valor biológico en relación a otras proteínas, y por su elevado contenido en cisteína que auxilia en funciones antioxidantes. Mediante hidrólisis química o en enzimática, las proteínas son escindidas en aminoácidos libres y/o péptidos de diferentes tamaños. La hidrólisis enzimática bajo condiciones moderadas de pH (6-8) y de temperatura (40-60 ⁰C) hace posible el obtener componentes nutricionales bioactivos con propiedades funcionales aumentadas. Esta hidrólisis busca optimizar la estabilidad térmica, disminuir la alergenicidad, producir biopéptidos, modelar la cantidad y tamaño de los péptidos para dietas especiales, y modificar las propiedades funcionales tales como gelación, emulsificación y formación de espumas. En los últimos años, se ha evidenciado que las proteínas lácteas son fuentes de péptidos bioactivos con potencial beneficio para la salud. Estos péptidos están inactivos dentro de la secuencia proteica de origen y pueden ser liberados durante el procesamiento del alimento o digestión gastrointestinal. Una vez liberados, los péptidos poseen diversas actividades biológicas, entre las cuales se destacan actividades regulatorias de los sistemas gastrointestinal, inmune, cardiovascular y nervioso. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las propiedades estructurales, funcionales y biológicas de hidrolizados de caseínas/caseinatos de origen bovino y ovino y proteínas del suero lácteo bovino obtenidos por hidrólisis enzimática con proteasas de origen bacteriano. Las proteasas, denominadas P7 y P45, consistieron en pooles enzimáticos obtenidos a partir de bacterias identificadas filogenéticamente como linajes de Bacillus sp. P7 y sp. P45 respectivamente, que habitan en el tracto intestinal del pez Piaractus mesopatamicus. En primer lugar, se caracterizaron las suspensiones acuosas de caseinato de sodio (NaCAS), evaluando la estabilidad coloidal de las mismas en ausencia y en presencia de iones calcio; determinándose la composición proteica, los cambios de tamaño medio y el volumen específico parcial de los agregados coloidales solubles. Además, se estudiaron los cambios conformacionales de dichos agregados mediante la determinación de la hidrofobicidad superficial y los espectros de fluorescencia de los fluoróforos intrínsecos proteicos. Comparativamente, se encontró que los agregados ovinos de caseinato de calcio fueron menos estables que los agregados bovinos. La diferencia observada podría deberse a la composición proteica de los agregados y una mayor cantidad de grupos fosfoserinas que actúan como sitios de unión al calcio. Estos estudios permitieron evaluar el estado inicial de las caseínas bovinas y ovinas previo a la hidrólisis enzimática, adquiriendo una mejor comprensión de su comportamiento frente al ion calcio. En segundo lugar, se obtuvieron los pooles enzimáticos a partir del cultivo en medios nutritivos económicos de los Bacillus sp. P7 y sp. P45, a los cuales se los denominó PEP7 y PEP45, respectivamente. Se determinó la actividad enzimática de los mismos usando azocaseína como sustrato. Luego, se realizó la hidrólisis de muestras de NaCAS bovino y ovino y de aislados de proteínas de lactosuero con PEP7 y PEP45, a diferentes tiempos de hidrólisis. Los hidrolizados obtenidos en cada caso fueron caracterizados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y estudios espectrofotométricos y espectrofluorimétricos. Se determinó la actividad antioxidante de los hidrolizados mediante la capacidad de captura del radical ácido 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS·+), el ensayo de captura del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH·), la actividad quelante del catión ferroso y del poder reductor. Además, se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica. En general, los hidrolizados proteicos evidenciaron actividad antioxidante. Dicha actividad puede proteger a los sistemas biológicos contra el daño vinculado al estrés oxidativo en casos de enfermedad. Estos hidrolizados antioxidantes pueden emplearse para prevenir las reacciones de oxidación, tales como la peroxidación lipídica, que conducen al deterioro de los alimentos. Además, evidenciaron propiedades antimicrobianas contra microorganismos causantes de intoxicaciones alimentarias y del deterioro de los alimentos y que también son patógenos oportunistas, agregando de esta forma calidad y seguridad en los productos alimenticios. Adicionalmente, la inhibición de hongos filamentosos podría representar una aplicación adicional como un nuevo agente antifúngico. También se estudió la capacidad de estos hidrolizados, obtenidos a distintos tiempos de hidrólisis, y sus mezclas con las proteínas de origen, de agregar y gelificar por disminución controlada del pH inducida por la adición de glucono-δ-lactona (GDL). A bajas concentraciones proteicas, se examinó la cinética del proceso de agregación ácida y el grado de compactación de los agregados obtenidos. La cinética de la agregación inicial de las partículas se evaluó por medidas turbidimétricas, interpretando los resultados según deducciones desarrolladas por nuestro grupo de trabajo. Los posibles cambios de tamaño y/o grado de compactación fueron estudiados basándose en la dependencia de la turbidez con la longitud de onda en el rango de 450-650 nm, rango en donde no hay absorción de los grupos cromóforos de la proteína. A partir de estos resultados se pudieron analizar las variaciones en la velocidad inicial del proceso de agregación y del grado de compactación de los agregados formados a la luz de la teoría de los fractales. La distinta naturaleza en composición, carga, tamaño y proteínas de origen de los péptidos obtenidos por las preparaciones enzimáticas se vieron reflejadas en sus distintos comportamientos para agregar ante la presencia de GDL, observándose, en algunos casos, pérdida de la capacidad de agregación, diferencias en la estabilidad electrostática o en el tiempo para iniciar la coagulación y en el grado de compactación alcanzado. Estudios de mezclas de los hidrolizados obtenidos con sus proteínas de origen sugieren la posibilidad de inclusión de los hidrolizados en una matriz de la proteína de origen sin alterar significativamente los perfiles de la agregación. Aunque el grado de compactación alcanzado puede relacionarse con las propiedades reológicas, se necesitaría realizar estudios adicionales para evaluar el efecto de la incorporación de los hidrolizados sobre la estructura y textura de los geles ácidos. A altas concentraciones proteicas, se investigó la variación de las propiedades reológicas durante el proceso de la gelación ácida. Estos ensayos fueron realizados bajo cizallamiento para determinar las propiedades viscoelásticas de los sistemas, a bajas deformaciones y para evaluar los sistemas durante la formación de los geles y en equilibrio. Para ello se utilizó un reómetro de tensión controlada y se estudió la cinética de la gelación, evaluando las variaciones de los módulos elástico (G’) y viscoso (G’’) en función del tiempo. También se estudió la microestructura de los geles formados (tamaño medio, distribución de tamaño de poros y parámetros de textura) mediante el análisis de imágenes obtenidas por microscopía convencional y confocal. Los resultados evidenciaron que no ocurrieron mayores cambios en la cinética del proceso, pero si en la elasticidad final alcanzada por los geles. La presencia de los hidrolizados condujo a la disminución del carácter elástico de los geles ya que dichos hidrolizados podrían dificultar los reordenamientos entre partículas. Sin embargo, en todos los casos predominó el carácter elástico sobre el viscoso. Adicionalmente, el análisis de la microestructura reveló que a medida que el tiempo de hidrólisis fue mayor, la cantidad de poros se incrementó y los mismos fueron de menor tamaño. De esta forma, la presencia de los hidrolizados en las mezclas contribuiría a que la estructura ordenada de los geles sea más débil, lo que concuerda con los valores de módulo elástico obtenidos. Por otra parte, se evaluó la capacidad PEP7 y PEP45 para coagular la leche bovina. Para ellos se evaluó la agregación post enzimática de suspensiones de micelas de caseína bovina reconstituidas a partir de leche en polvo descremada. Se aplicaron diseños de experimentos que permitieron evaluar la significancia de los factores independientes pH y temperatura sobre las variables dependientes o respuestas analizadas (actividad coagulante de micelas de caseína, tamaño medio de poros y parámetros de textura). Se obtuvieron ecuaciones modelo que permitieron evaluar y predecir el comportamiento de los sistemas bajo las diferentes condiciones ensayadas. A los sueros, producto de la sinéresis al final de este proceso de coagulación, se les determinó la capacidad antioxidante utilizando los métodos anteriormente enunciados.